甘氨酸受体α1亚基在乳鼠心肌细胞的表达及损害性因素对其表达的影响*

陈楚天1△，陆大祥2，戚仁斌2，王华东2

(1广东省公共卫生研究院,广东 广州511430；2暨南大学医学院病理生理教研室，广东 广州 510632)

[摘要]目的： 研究甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)在乳鼠心肌细胞中的表达以及脂多糖(LPS)、缺氧/复氧(H/R)、异丙肾上腺素(ISO)和高糖(HG)对其表达的影响。方法: 体外培养乳鼠心肌细胞，Western blotting方法检测心肌细胞上GlyRα1的表达；心肌细胞分别用LPS、H/R、ISO以及HG处理24 h，采用CCK-8试剂检测细胞活力，Western blotting方法检测心肌细胞上GlyRα1的表达。结果: Western blotting 方法检测到乳鼠心肌细胞上GlyRα1的表达；LPS(20 mg/L)、ISO(100 μmol/L)以及HG(25mmol/L)处理心肌细胞24 h与心肌细胞H/R 3 h对心肌细胞存活率无明显影响；LPS组、H/R 3 h组以及ISO组心肌细胞上GlyRα1表达均高于对照组(P<0.01)，而HG组心肌细胞上GlyRα1表达低于对照组(P<0.01)。结论: 乳鼠心肌细胞上存在GlyRα1，并且一定浓度的LPS、ISO与一定时间的H/R均可上调乳鼠心肌细胞GlyRα1的表达，而HG可下调乳鼠心肌细胞GlyRα1的表达。

[关键词]甘氨酸受体α1； 脂多糖； 缺氧/复氧； 异丙肾上腺素； 高糖

[中图分类号]R363[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.013

[文章编号]1000-4718(2015)11-2009-07

[收稿日期]2015-04-22[修回日期] 2015-09-21

[基金项目]*辽宁省教育厅科学研究一般项目(No. L2013399)；沈阳医学院博士科研启动基金资助项目(No. 20133050)

通讯作者△Tel: 024-62217129; E-mail: sunflowerzlq@163.com

Effects of several harmful factors on expression of glycine receptor α1subunit in neonatal rat myocardial cellsCHEN Chu-tian1, LU Da-xiang2, QI Ren-bin2, WANG Hua-dong2

(1GuangdongProvincialInstituteofPublicHealth,Guangzhou511430,China;2DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:cct104@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To study the expression of glycine receptor α1 subunit in neonatal rat myocardial cells and to investigate the effect of lipopolysaccharide (LPS), hypoxia/reoxygenation, isoproterenol (ISO) and high concentration of glucose (HG) on the expression of glycine receptor α1 subunit in the neonatal rat myocardial cells. METHODS: Neonatal rat myocardial cells were cultured in vitro. The expression of glycine receptor α1 subunit was detected by Western blotting. The neonatal rat myocardial cells were treated with LPS (20 mg/L), ISO (100 μmol/L) or high concentration of glucose (25 mmol/L) for 24 h, or were exposed to hypoxia for 3 h followed by reoxygenation for 3 h. Subsequently, the cell viability was measured by CCK-8 assay， and the expression of glycine receptor α1 subunit was determined by Western blotting. RESULTS: The expression of glycine receptor α1 subunit in the neonatal rat myocardial cells was positively detectable by Western blotting. Compared with control group, no significant difference of the cell viability (P>0.05) in LPS group, ISO group, hypoxia/reoxygenation group and HG group was observed. The expression of glycine receptor α1 subunit was increased (P<0.01) in LPS group, ISO group and hypoxia/reoxygenatio group, but decreased (P<0.01) in HG group. CONCLUSION: Glycine receptor α1 subunit exists in the neonatal rat myocardial cells. A certain concentration of LPS or ISO, or hypoxia/reoxygenation for a certain period upregulate the expression of glycine receptor α1 subunit, but HG downregulates the expression of glycine receptor α1 subunit in cultured neonatal rat myocardial cells.

[KEY WORDS]Glycine receptor α1subunit; Lipopolysaccharides; Hypoxia/reoxygenation; Isoproterenol; High concentration of glucose

我们先前的研究发现，甘氨酸(glycine，Gly)对缺血/再灌注损伤的心脏[1]、缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤的心肌细胞以及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)损伤的心脏和心肌细胞都有保护作用[2]，通过大量研究，我们认为Gly对心脏的保护作用是由心肌细胞上的甘氨酸受体(glycine receptor, GlyR)介导的。内毒素血症、缺血/再灌注、交感神经系统的过度激活与高血糖是临床上常见的心肌损伤因素。我们先前的研究表明，乳鼠心肌细胞甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)mRNA的表达水平受这些损伤因素的调节[3]，然而，与之相应的，这些损伤因素可否影响心肌GlyRα1蛋白的表达水平尚缺乏研究。因此，本研究旨在观察LPS、H/R、异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)以及高糖(high concentration of glucose，HG)对乳鼠心肌细胞GlyRα1蛋白表达的影响。

材料和方法

1主要仪器

CO2培养箱(Thermo)、酶标仪(Tecan)、Western blotting蛋白印迹电泳仪和蛋白印迹电转仪(Bio-Rad)

2药品和试剂

DMEM培养基(Gibco);胎牛血清(中国医学科学院血液学研究所产品);胰蛋白酶(Hyclone)；CCK-8试剂(日本同仁化学研究所)；GlyRα1多克隆抗体(Abcam)；天然膜蛋白抽提试剂盒(BioVision)；ECL发光液(Pierce)；LPS(Sigma)；ISO(上海禾丰制药有限公司)；葡萄糖(天津化学试剂一厂)。

3方法

3.1心肌细胞培养无菌条件下取出出生1～3 d SD大鼠乳鼠(中山大学实验动物中心)心脏，取心室肌剪碎,0.125%胰蛋白酶消化成单细胞悬液,离心弃上清,用含15%胎牛血清的DMEM培养基悬浮分散细胞,100目筛网过滤,将细胞悬液接种于25 mL培养瓶中,在CO2孵箱中(95% O2,5% CO2,37℃)培养90 min后,弃去贴壁的成纤维细胞，加入含15%胎牛血清的DMEM培养基, 制成(1～5)×105cells/L细胞悬液接种于另一培养瓶或培养板中,每24 h换液1次,72 h后,选取搏动良好的心肌细胞进行实验。

3.2乳鼠心肌与脊髓组织的提取乳鼠脱颈致死后, 快速取出心脏与腰骶段脊髓(L5～S1)于液氮中保存，用匀浆器将组织匀浆，抽提总蛋白。

3.3心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型的建立[4]参照文献的方法。实验组心肌细胞用混合气体(95%N2,5%CO2)预先饱和1 h的模拟缺血溶液(137 mmol/L NaCl，12 mmol/L KCl，0.9 mmol/L CaCl2·2H2O，0.49 mmol/L MgCl2，20 mmol/L乳酸钠，0.4 mmol/L HEPES，pH 6.2)置换正常培养液，放入缺氧装置中，充入混合气体(95% N2,5% CO2)后密封，放入培养箱内培养3 h，即为缺氧模型。3 h后用正常培养液置换缺氧液，开放瓶口，放入常氧环境中培养3 h，即为复氧模型。

3.4实验分组心肌细胞培养72 h后随机分为5组。对照组、LPS(20 mg/L)组、ISO(100 μmol/L)组和HG(25 mmol/L葡萄糖)组分别培养心肌细胞24 h，H/R组的心肌细胞进行缺氧3 h后复氧3 h处理。

3.5细胞活性的测定以1×105cells/L细胞悬液接种至96孔培养板中,每组设6复孔，72 h后按上述分组进行培养。H/R组按上述H/R模型的方法缺氧3 h后复氧3 h；LPS、ISO和HG组加入相应浓度的LPS、ISO和葡萄糖培养24 h;每孔加入10 μL CCK-8试剂，微量振荡器振荡5 min, 置于CO2培养箱中(95% O2，5% CO2,37 ℃)培养30 min，用酶标仪检测每孔液体的吸光度(A)值。细胞存活率(%)=(A实验-A空白)/(A对照-A空白)×100%。

3.6Western blotting 检测心肌细胞GlyRα1蛋白的表达分别抽提乳鼠心肌细胞、心肌组织与脊髓组织总蛋白，BCA法测量蛋白浓度，上样，SDS-PAGE分离蛋白，转膜，封闭，抗体孵育(GlyRα1和GAPDH抗体稀释比例分别是1∶250 和1∶1 000)，采用化学发光法显色，用专用软件对蛋白条带灰度值进行分析。

4统计学处理

采用SPSS 20.0软件分析,所有数据用均数±标准差(mean±SD)表示,组间均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1LPS、H/R、ISO以及HG对心肌细胞活性的影响

如表1所示，LPS组、ISO组、HG组和H/R组心肌细胞存活率与对照组比较无显著差别。

2乳鼠心肌细胞GlyRα1蛋白的表达

乳鼠心肌细胞、心肌组织和脊髓组织(阳性对照)均有GlyRα1蛋白表达，见图1。

表1四种损害性因素对乳鼠心肌细胞毒性的测定

Table 1.Effects of four harmful factors on survival rate of neonatal rat myocardial cells (%. Mean±SD.n=6)

GroupCellsurvivalrateControl90.80±2.63LPS90.55±1.92H/R91.27±2.54ISO90.86±2.81HG90.46±2.80

Figure 1.Western blotting for GlyRα1protein expression.

图1乳鼠心肌细胞、心肌组织与脊髓组织GlyRα1蛋白的表达

3LPS、H/R、ISO以及HG对乳鼠心肌细胞GlyRα1蛋白表达的影响

Western blotting结果分析显示，与对照组相比，LPS、ISO和H/R均可增加GlyRα1蛋白的表达，而HG可降低GlyRα1蛋白的表达(P<0.01),见图2。

Figure 2.Effects of LPS, H/R, ISO and HG on GlyRα1protein expression in cultured neonatal rat myocardial cells. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

图2LPS、H/R、ISO和HG作用下乳鼠心肌细胞GlyRα1蛋白表达的变化

讨论

本室先前的研究表明Gly对缺血/再灌注损伤的心脏、缺氧/复氧损伤的心肌细胞的保护作用通过心肌细胞上GlyR介导实现的，而对GlyR各亚基功能的研究表明，α亚基因其含有与激动剂、拮抗剂结合的位点而成为GlyR功能的决定因子[5-7]，本人先前的研究表明，乳鼠心肌细胞GlyRα1mRNA的表达水平受LPS、H/R、ISO以及HG这些损伤因素的调节，本次实验是在先前的实验结论的基础上进一步探讨GlyRα1蛋白在乳鼠心肌细胞的表达，以及以上损害因素对其蛋白水平表达的影响。

1乳鼠心肌细胞GlyRα1蛋白的表达

在生物体CNS上GlyRα1蛋白的表达早已得到多数学者的证实，而对于心肌细胞上是否有GlyRα1蛋白的表达尚未得到证实。本室先前对GlyR的研究发现，采用灵敏度较高的逆转录-巢式聚合酶链反应技术在乳鼠心肌细胞上能够检测到GlyRα1mRNA的表达，但在应用Western blotting方法进一步验证此研究结果时却未能发现有相同的免疫活性和分子量大小的蛋白存在，这使得本研究在实验方案和实验技术方面具有相当大的挑战性。本研究在检测GlyRα1蛋白的表达时，采用提高心肌细胞膜蛋白的浓度、调整Ⅰ抗和Ⅱ抗的最佳反应浓度等方法最终成功地首次检测到心肌细胞GlyRα1蛋白的表达，不仅完善了本室前期的工作，而且也是本研究的重要部分是否能够顺利开展的关键之处。本研究表明乳鼠心肌细胞上不但有GlyRα1蛋白的表达，并且受损害性因素的调节。

2损害性因素对乳鼠心肌细胞GlyRα1蛋白表达的影响

本研究发现，乳鼠心肌细胞在20 mg/L LPS处理24 h后、100 μmol/L ISO处理24 h后与H/R(各3 h)处理下(细胞存活率不受影响)均可增加GlyRα1蛋白水平的表达，提示一定浓度的LPS、ISO以及一定时间的H/R可通过上调GlyRα1的表达来正性调节GlyR的功能；25 mmol/L葡萄糖处理乳鼠心肌细胞24 h后，细胞存活率不受影响，GlyRα1蛋白水平的表达低于对照组，该结果提示HG可下调GlyRα1的表达，从而负性调节GlyR的功能。以上研究结果与我们之前的研究结果一致，即一定浓度的LPS、ISO以及一定时间的H/R可通过上调GlyRα1mRNA的表达水平来正性调节GlyR的功能，而HG可下调GlyRα1mRNA的表达水平，从而负性调节GlyR的功能。

近年来对GlyR的深入研究发现，GlyR的功能随着机体发育阶段的变化而变化。在机体神经系统的发育早期与成熟期，GlyR的激活对神经元兴奋性的调节有着截然不同的作用，并且与细胞内Ca2+的浓度密切相关[8-9]。在机体的神经元成熟期，细胞内Cl-浓度低于平衡浓度，此时激活GlyR的Cl-通道引发Cl-内流，表现为抑制效应；而对于发育早期而言，细胞内Cl-浓度高于平衡浓度，此时激活GlyR的Cl-通道引发Cl-外流，膜去极化，兴奋神经元，继而兴奋电压依从性Ca2+通道，Ca2+内流，细胞内Ca2+的浓度增加可使细胞产生特异的功能[10-11]。Fucile等[12]在大鼠脊髓神经元和转染人细胞系发现了一个能够快速增效GlyR功能的因素——细胞内Ca2+，此快速增强作用的发展时程小于100 ms并与Ca2+内流相一致，该研究提示细胞内Ca2+能够明显增加GlyR与Gly的亲和力来上调GlyR的功能。这些研究结论与本实验的LPS、H/R、ISO这3种因素对GlyRα1mRNA表达影响的结果相一致。本实验中的4种因素造成心肌细胞损伤的共同机制之一是引发细胞内钙超载，随着损伤因素浓度的增高心肌细胞内Ca2+的浓度也逐渐增加，心肌细胞内Ca2+的浓度逐渐增加进而激活GlyR表达的逐渐增多，从而上调GlyR的功能。但是HG对GlyRα1mRNA表达的影响却与此相反，这可能与HG所致心肌损伤的诸多中间机制有关。研究证实，HG(20 mmol/L、30 mmol/L)明显抑制乳鼠心肌细胞牛磺酸转运[13]，而牛磺酸与Gly结构相似，同是GlyR的激动剂，HG可能通过抑制了与牛磺酸结构相似的GLy转运来抑制GlyR的表达，下调了GlyR的功能。

本实验研究表明，一定浓度的LPS与ISO以及一定时间的H/R均能增加乳鼠心肌细胞GlyRα1蛋白水平的表达；而HG能够使乳鼠心肌细胞GlyRα1蛋白水平的表达减少。提示这些损伤心肌的因素能够调节GlyR的功能，其确切机制还需深入研究。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)