糖尿病溃疡中Wnt/β-catenin信号通路表达的变化*

赵亚男1，刘明2△，张玥2，王彬2，张玉冬2，苏海文3，任晓兰4，郝清智2

(山东中医药大学1第一临床医学院，2附属医院周围血管病科，山东 济南 250014；青岛市第三人民医院3麻醉科，4心内科，山东 青岛 266000)

[摘要]目的： 观察糖尿病(DM)溃疡中Wnt/β-catenin信号通路表达的变化，探讨该信号通路在糖尿病难愈性溃疡中的作用。方法: 雌性Wistar大鼠采用高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素液腹腔注射法制备糖尿病模型。分别取正常对照组与DM组制作溃疡模型。观察创面造模后第3天、第7天和第14天对照组及DM组创面愈合情况的变化，并采用HE染色法检测创面组织形态结构的变化，采用ELISA法和RT-PCR法检测创面组织中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白及mRNA的变化。结果: DM组大鼠的创面愈合率明显低于对照组(P<0.05)，且与对照组相比，其创面组织中含有较少的炎性细胞、纤维母细胞及新生毛细血管。DM组大鼠创面组织中β-catenin和Rspo-3蛋白及mRNA的表达水平均低于对照组，GSK-3β蛋白及mRNA的表达水平均高于对照组(P<0.05)。结论: Wnt/β-catenin通路的下调有可能导致了糖尿病溃疡的难愈，而该通路的下调可能源自于Rspo-3蛋白表达的下降。

[关键词]糖尿病溃疡； Wnt信号通路； β-catenin； GSK-3β； Rspo-3

[中图分类号]R587.1; R363.2[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.018

[文章编号]1000-4718(2015)11-2039-08

[收稿日期]2015-03-23[修回日期] 2015-09-22

[基金项目]*国家科技重大专项(No. 2009ZX09503-025)

通讯作者△Tel: 0851-28608065; E-mail: cellgene@163.com

Expression changes of Wnt/β-catenin signaling pathway in diabetic ulcerZHAO Ya-nan1, LIU Ming2, ZHANG Yue2, WANG Bin2, ZHANG Yu-dong2, SU Hai-wen3, REN Xiao-lan4, HAO Qing-zhi2

(1FirstMedicalCollege,2DepartmentofVascularSurgery,TheAffiliatedHospital,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250014,China;3DepartmentofAnesthesiology,4DepartmentofCardiology,TheThirdPeople’sHospitalofQingdao,Qingdao266000,China.E-mail:liuming404@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To observe the effect of Wnt/β-catenin signaling pathway on diabetic ulcer. METHODS: Diabetic animal model was established in the female Wistar rats by intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin following high-fat diet feeding. A circular wound was made on the dorsum of the rats in both control group and diabetic group. The condition of wound healing was recorded and the structures of the wound tissues were observed by HE staining in the 2 groups at 3, 7 and 14 d after wounding. The expression of β-catenin, GSK-3β and Rspo-3 at mRNA and protein levels in the wound tissues was detected by RT-PCR and ELISA. RESULTS: In diabetic group, the wound healing rate was lower (P<0.05), and the inflammatory cells， fibroblast cells and new capillaries in the wound tissues were fewer than those in control group. The expression of β-catenin and Rspo-3 at mRNA and protein levels in the wound tissues in control group was significantly higher than those in diabetic group, and the expression of GSK-3β was exactly the opposite (P<0.05). CONCLUSION: The down-regulation of Wnt/β-catenin probably resultes from the decreased level of Rspo-3, which may be one of the reasons for delaying the diabetic ulcer healing.

[KEY WORDS]Diabetic ulcer; Wnt signaling pathway; β-catenin; GSK-3β; Rspo-3

糖尿病溃疡(diabetic ulcer，DU)是极具代表性的难愈性溃疡。据统计，30%的糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者会发生皮肤溃疡，且反复发作，经久不愈，严重者会导致截肢或者引发脓毒血症而危及生命[1]。导致DU难愈的原因较复杂，信号通路表达的变化是其中之一。有研究发现，Wnt信号通路与创面愈合密切相关[2]。为了研究糖尿病溃疡中Wnt/β-catenin信号通路表达的变化，我们制作糖尿病溃疡的大鼠模型，通过观察溃疡组织形态结构的变化，及检测创面组织中Wnt信号通路相关的β-连环素(β-catenin)、糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)和R-spondin 3(Rspo-3)的蛋白及mRNA的表达水平，以探讨Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病溃疡创面难愈中的作用机制。

材料和方法

1材料

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购于Sigma；大鼠ELISA试剂盒购于R&D；Oligo(dT)、Ribonuclease Inhibitort和DEPC购于Bio Basic INC；Reverse Transcriptase、Taq DNA Polymerase和GeneRulerTM100 bp DNA Ladder购于Fermentas； dNTP Mix、Agarose I-B购于上海生工生物工程有限公司。引物由上海博尚生物技术有限公司合成。

2方法

2.1糖尿病大鼠模型的建立及分组清洁级雌性Wistar大鼠34只，体重160 g～180 g，购自山东大学动物实验中心。大鼠按随机数字表随机分为正常对照(control)组和糖尿病(DM)组。适应性饲养1周后，分别记录2组大鼠的体重、进食量、饮水量、排泄量，并采用断尾取血法测定大鼠的随机血糖。对照组给予普通饲料继续饲养，DM组给予高脂高糖饲料(59%基础饲料、20%蔗糖、18%猪油、3%蛋黄，由北京科澳协力饲料有限公司加工制作)饲养。饲养4周后，分别记录2组大鼠的体重、进食量、饮水量、排泄量及随机血糖。此后，2组大鼠均禁食12 h，DM组给予30 mg/kg、1%的STZ溶液(临用前用0.1 mol/L、pH 4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)单次腹腔注射，对照组注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射后第3天测随机血糖，血糖≥16.67 mmol/L为糖尿病造模成功；造模不成功者再次空腹12 h后注射10 mg/kg、1% STZ溶液。维持高血糖状态4周后，再次记录2组大鼠的体重、进食量、饮水量、排泄量及血糖，并进行创面造模。

2.2糖尿病溃疡大鼠模型的建立维持高血糖状态4周后，将2组大鼠以3%的戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射进行麻醉，麻醉成功后，背部脱毛，常规消毒，在背部制作直径约为2.5 cm的圆形创面，深至皮下。溃疡造模时，2组大鼠各死亡1只。每组大鼠各随机选取15只，进行观察。

2.3创面愈合情况观察创面造模后第3、7和14天对创面进行大体观察，主要包括创面颜色、肿胀程度、渗液量等，并用数码相机拍照，通过Photoshop软件，记录创面面积[3]。

2.4创面组织HE染色分别于创面造模后第3、7和14天，每组大鼠各随机抽取5只，戊巴比妥钠麻醉成功后，采集创面及创周2 mm的组织，4%多聚甲醛固定后，经冲洗-取材-脱水-透明-浸蜡-包埋-切片-贴片等步骤后制成组织切片，再将石蜡切片脱蜡、水化后，进行组织切片的HE染色，以观察创面的组织学变化，包括毛细血管、胶原蛋白、成纤维细胞等的变化。

2.5创面组织β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白的ELISA检测分别于创面造模后第3、7和14天，每组大鼠各随机抽取5只，戊巴比妥钠麻醉成功后，采集创面及创周2 mm的组织，应用ELISA法检测其中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白的的含量。

2.6RT-PCR检测创面组织β-catenin、GSK-3β和Rspo-3的mRNA表达分别于溃疡造模后第3、7和14 d，每组大鼠各随机抽取5只，戊巴比妥钠麻醉成功后，采集创面及创周2 mm的组织，应用RT-PCR法检测其中β-catenin、GSK-3β、Rspo-3的mRNA含量。检测前，先将组织剪碎，采用TRIzol法提取总RNA，测RNA浓度及纯度，调整RNA浓度，建立30 μL的RT-PCR体系[Oligo(dT)1 μL+RNA 17 μL+5× buffer 6 μL+dNTP 3 μL+RNase 1.5 μL+M-MLV 1.5 μL]。产物进行PCR，再建立25 μL体系(template DNA 4 μL+2× Taq Master Mix 12.5 μL+P1/P2 10 μmol/L 2 μL+RNase-free water 6.5 μL)。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。其中β-catenin的上游引物序列为5’-CTGACCAAACTGCTAAATGACG-3’，下游引物序列为5’-GTGGTGATGGCGTAGAACAGTA-3’；GSK-3β的上游引物序列为5’-GGACCTCGGAGCAAGTTTCA-3’，下游引物序列为5’-AGGCTCCCTCCAAGATCCAT-3’；Rspo-3的上游引物序列为5’-GTACACTGTGAGGCCAGTGAA-3’，下游引物序列为5’-ATGGCTAGAACACCTGTCCTG-3’。

3统计学处理

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，统计处理用SPSS 20.0软件进行分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1大鼠一般情况的变化

糖尿病造模后，随着病情的进展，DM组大鼠毛色逐渐灰暗、枯黄、杂乱，皮肤及皮下脂肪变薄，多饮、多食、多尿明显。而对照组大鼠毛发细密、光亮，皮下脂肪丰满，体重逐渐增加。

2大鼠体重、进食量、饮水量、排泄量和血糖的变化

适应性饲养1周后及注射STZ之前，2组大鼠的体重、平均每日进食量、饮水量和排泄量均无明显差异；而注射STZ后，DM组大鼠进食量、饮水量和排泄量均增加，体重增长缓慢，与对照组相比，差异显著(P<0.05)，见表1。注射STZ之前，2组大鼠的随机血糖无明显差异，注射STZ后，DM组随机血糖明显高于对照组，差异显著(P<0.05)，见表2。

表1　大鼠体重、进食量、饮水量和排泄量的变化

*P<0.05vscontrol group.

表2大鼠血糖的变化

Table 2.The changes in the blood glucose level of the rats (mmol/L. Mean±SD.n=17)

Group1weekafteradaptivebreedingBeforeinjectingSTZBeforewoundingControl6.06±0.306.09±0.295.99±0.15DM6.13±0.326.11±0.3126.89±2.78*

*P<0.05vscontrol group.

3创面愈合情况

对照组的创面在造模后第3天可见色红润，轻度水肿，少量渗出，可见少量肉芽组织；第7天，创面缩小明显，肉芽色红润，无明显渗出，表面有痂皮覆盖，创缘可见淡红色新生上皮；第14天，创面缩小明显，创周可见淡红色新生上皮。DM组的创面组织在造模后第3天呈轻度水肿，色暗红，渗出较多，可见少量黄白色分泌物；第7天，肉芽水肿，色暗红、无光泽，渗出多；创伤后第14天，创面缩小，渗出减少，创周可见淡红色上皮爬行，见图1。

Figure 1.The changes of wound healing in the rats.

图1大鼠创面愈合情况的变化

4创面愈合率

创面造模后第3、7和14天，对照组大鼠的创面愈合率均高于DM组，差异显著(P<0.05)，见表3。

表3大鼠创面愈合率的变化

Table 3.The changes of the wound healing rate in the rats (%. Mean±SD)

GroupDay3Day7Day14Control20.87±1.3949.99±1.5891.60±1.58DM5.21±0.94*31.70±1.21*62.20±1.37*

*P<0.05vscontrol group.

5创面组织的HE染色

对照组的创面在造模后第3天可见炎症细胞浸润明显，有少量纤维母细胞及少量新生毛细血管；第7天可见肉芽组织，纤维母细胞生长活跃，新生毛细血管数量增加，有较多炎症细胞及少量胶原纤维；第14天可见新生表皮及肉芽组织，有少量炎细胞、纤维母细胞及毛细血管，可见较多胶原纤维。DM组的创面在造模后第3天有少量炎症细胞、纤维母细胞及新生毛细血管；第7天可见炎症细胞浸润，有少量纤维母细胞及新生毛细血管，少量胶原纤维；第14天可见新生表皮及肉芽组织，有少量炎细胞、纤维母细胞及毛细血管，可见胶原纤维，见图2。

Figure 2.The changes of the structure of the wound tissues (HE staining, ×100).

图2大鼠创面组织的HE染色

6创面组织中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白的表达

ELISA结果显示，创面造模后第3、7和14天，DM组创面组织中β-catenin和Rspo-3蛋白的含量均低于对照组(P<0.05)。而DM组创面组织中GSK-3β蛋白的含量高于对照组(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The protein expression of β-catenin, GSK-3β and Rspo-3 in the wound tissues. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

图3大鼠创面组织中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白的表达

7创面组织中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3的 mRNA表达

RT-PCR的结果显示，创面造模后第3、7和14天，DM组创面组织中β-catenin和Rspo-3 的mRNA含量均低于对照组(P<0.05)。而DM组创面组织中GSK-3β的mRNA含量高于对照组(P<0.05)，见图4。

Figure 4.The mRNA expression of β-catenin, GSK-3β and Rspo-3 in the wound tissues. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

图4大鼠创面组织中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3的mRNA表达

讨论

糖尿病溃疡是糖尿病的常见并发症之一，具有发病原因复杂、病程长、治疗困难、预后较差的特点，往往迁延不愈，严重者可导致脓毒血症或截肢。糖尿病患者中发生足部溃疡的概率大约为12%～25%[4]。Dohmen等[5]报道，在德国每年有40 000例截肢患者，其中70%是糖尿病患者。导致DU难愈的原因较复杂，信号通路表达的变化是其中之一。

Wnt信号通路是一条高度保守的信号转导通路，主要有3条途径，其中经典途径即Wnt/β-catenin通路。在正常成熟细胞中，Wnt通路处于关闭状态，胞浆中几乎没有游离的β-catenin[6]。当Wnt信号通路被激活时，Wnt蛋白与细胞表面受体卷曲蛋白(Frizzled，Frz)及低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)结合，胞内散乱蛋白(Dishevelled，Dsh或Dvl)与Frz胞内区结合后被磷酸化激活，抑制GSK-3β的活性，使得β-catenin不能被磷酸化，不能被泛素-蛋白酶体系降解。不能降解的β-catenin在胞质内大量积累并进入核内，与转录活化因子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)结合，启动下游靶基因的表达[7]。Wnt信号通路可被皮肤损伤激活，并参与到从炎症控制到细胞凋亡的伤口愈合的每一个过程中[2]。

β-catenin是胞浆内分子量约为92～95 kD的多功能蛋白质[8]，其在Wnt信号通路中发挥核心作用，且Wnt通路的刺激是使β-catenin稳定性增强的唯一机制[9]。GSK-3β是一种普遍存在于细胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它位于降解复合体β-catenin-APC-Axin的关键位置，是决定复合体中β-catenin磷酸化的重要激酶[10]。Rspo蛋白家族包括4个成员(Rspo-1～4)，其与Wnt信号通路之间存在着密切的联系。Kazanskaya等[11]首次证明了Rspo蛋白可以激活Wnt信号通路，也有研究认为Rspo蛋白是诱导经典Wnt信号通路的新一类的信号配体[12]。然而，尽管所有的Rspo蛋白均可以激活Wnt通路，但是Rspo-3和Rspo-2比Rspo-1更有效，而相比之下，Rspo-4是不活跃的[13]。

在本实验中，DM组大鼠与对照组大鼠相比，溃疡愈合减慢，肉芽生长不良，创面组织的HE染色证实DM组炎症细胞、纤维母细胞、新生毛细血管等较少，这与劳国娟等[14]研究发现的糖尿病皮肤创面细胞凋亡增加的结果相近，也证实本实验成功模拟了糖尿病难愈性溃疡。

经检测发现，DM组大鼠创面组织中β-catenin的表达低于对照组，这与研究发现的高浓度葡萄糖可使细胞中β-catenin蛋白表达下降的结果相一致[15]。有研究显示，β-catenin与皮肤发育、创伤愈合关系密切，参与创面愈合的各个方面[16]，β-catenin的表达增强可促进皮肤表皮细胞、角质细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞增殖、分化和迁移能力增强[17]。本实验中，糖尿病溃疡大鼠创面组织中呈现出的较少的纤维母细胞、较少的毛细血管，这也与较低水平的β-catenin表达相一致。本实验检测尚发现，糖尿病溃疡大鼠创面组织中GSK-3β的表达高于对照组，这与GSK-3β作为Wnt信号通路的负性调控因子的生理作用是相符的。Rspo蛋白作为Wnt信号通路的激活因子，在本实验中发现，其在糖尿病溃疡大鼠创面组织中呈现低表达，据此推测糖尿病溃疡中Wnt信号通路的下调可能源自其对Rspo蛋白的调降作用。

通过本实验，我们发现Wnt/β-catenin通路的下调有可能导致了糖尿病溃疡的难愈，而该通路的下调可能源于糖尿病对Rspo蛋白的调降产生，但具体的机制仍需进一步探索。我们试图通过本实验从一个新的角度揭示糖尿病溃疡的难愈机制，拟为临床治疗糖尿病溃疡提供新的思路。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)