王佳南 林建安 杜苗苗

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2018.33.029

[摘要] 目的 探求优化的原代培养乳鼠心肌细胞方法。 方法 2017年6月1日—2017年6月2日选取泉州市医学高等专科学校提供6只出生24 h内Wistar乳鼠，采用2种不同消化心肌组织的方法，对照组予0.125%胰酶+0.05%I型胶原酶+0.1%Ⅱ型胶原酶逐次消化心肌组织;试验组予0.05%I型胶原酶+0.1%Ⅱ型胶原酶消化数次后再单予 0.125%胰酶快速消化心肌组织;比较两组取得的心肌细胞数量以及存活率，免疫荧光测肌钙蛋白鉴定纯度。 结果 2种方法均得到心肌细胞数量多[对照组（103.3±4.4），试验组（105.8±5.0）]，差异无统计学意义（t=-0.911，P=0.384）;细胞即刻存活率试验组明显高于对照组，试验组达91.87%，对照组即刻存活率仅68.07%，差异有统计学意义（χ2=81.0，P=0.025）。试验组存活率明显高于对照组。结论 再改良方法提取心肌细胞，可获得存活率高、活力好的心肌细胞。

[关键词] 心肌细胞;原代培养;乳鼠

[中图分类号] R813.11          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2018）11（c）-0029-03

乳鼠心肌细胞培养技术已广泛应用于心血管疾病防治研究领域，其培养技术备受关注[1]。这一技术关键是如何获得收获率高、存活率高、纯度高且生长活力好的心肌细胞。近40多年来国内外诸多学者对乳鼠心肌细胞的培养方法作了多次的改进，但影响心肌细胞培养结果的因素较多，使得心肌细胞培养的收获率、存活率及活力难以稳定，参差不齐。因此该文在既往研究方法[2]基础上于2017年6月1日—2017年6月2日选择6只出生24 h内Wistar乳鼠进行心肌细胞原代培养的再改良。

1  材料与方法

1.1  动物出生24 h内的Wistar乳鼠

由泉州市医学高等专科学校实验动物中心提供。

1.2  主要试剂

胰蛋白酶（Sigma）， I型胶原酶（Gibco），Ⅱ型胶原酶（Gibco）等。

1.3  方法

①2017年6月1日于泉州市医学高等专科学校实验中心选取6只出生24 h内Wistar乳鼠，无菌下剪取心室心尖部分，在PBS液中充分洗涤，将其剪成糊状，分成两份置于离心管中待消化。

对照组每次予加入5 mL的0.125%胰酶+0.05%I型胶原酶+0.1%Ⅱ型胶原酶混合液，每次消化10 min，如上消化6～7次。

试验组予加入5 mL 0.05%I型胶原酶+0.1%Ⅱ型胶原酶混合液，每次消化15 min，共2次，而后单予加入5 mL 0.125%胰酶快速消化剩余组织，每次5 min，如上消化6～7次。

收取对照组和试验组上清液，予终止消化，予过滤后离心（900 r/min，5 min），用胎牛血清重悬细胞液，接种于培养板中，差速贴壁去除成纤维细胞（共2次），此后由具备良好心肌细胞培养技术经验实验室人员对接种心肌细胞进行培养及管理，避免对心肌细胞形态学观察的主观性偏差（单盲）。

②对照组和试验组获取心肌细胞，倒置显微镜下计数获得细胞数量，共计数6次，取均值。获得细胞用台盼蓝染色，倒置显微镜下观察心肌细胞。存活率=存活细胞数/ 细胞总数×100%，共计数40次，取均值。

③用DAPI标记细胞的细胞核，免疫荧光抗肌钙蛋白抗体试剂标测细胞质，检测肌钙蛋白抗体百分比来鉴定心肌细胞纯度。

④心肌细胞的纯度检测采用免疫细胞荧光法检测含有抗肌钙蛋白抗体（CTNT）的百分比。细胞纯度（%）=cTnT阳性细胞染色数/DAPI核染细胞总数×100%。

1.4  统计方法

采用SPASS 22.0 统计软件数据分析，两组间计量资料比较用独立样本t检验，计数资料采用χ2检验，分别用（x±s）、百分率（%）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  比较获取细胞数量及存活率

台盼蓝对收获心肌细胞进行染色，死的细胞染蓝色，存活细胞不染色，计算细胞总数及存活率。获得心肌细胞数量上对照组和试验组差异无统计学意义（P=0.384），表1，对照组即刻存活率68.07%，试验组达91.87%，试验组的即刻存活率显著高于对照组（P=0.025），见表2。

2.2  测定心肌细胞

分别取对照组和试验组培养心肌细胞（由具备心肌细胞培养技术其他实验室人员执行），DAPI标记细胞核，荧光肌钙蛋白抗体标记细胞质，见图1。用倒置荧光显微镜观察，所有细胞DAPI染色后细胞核呈蓝色荧光（图A）心肌细胞经肌钙蛋白抗体标记后显示绿色荧光（图B）。

3  讨论

乳鼠心肌细胞原代培养目前作为心血管疾病研究的一项基本技术。传统Simpson法在实际应用中发现存在不足，其细胞收获量及存活率很低，因此一些改进方法应运而生。该研究在既往心肌细胞培养方法基础上进行再次改良，研究中采用了不同次序0.05%I型胶原酶+0.1%Ⅱ型胶原酶+0.125%胰酶联合消化方法，简单快捷的分离出较多数量的心肌细胞，获取心肌细胞数量达6×106，此与近期其他文献报道[3-4]获取心肌细胞数量相一致。归其原因考虑心肌组织中含有多种类型的间质胶原，单一消化酶难以把心肌组织充分解离成单个细胞，而实验中两组均采用I型和II型胶原酶与胰酶组成混合消化酶，能较有效的把成团心肌组织充分消化，把含有多种类型间质胶原的心肌组织充分解离，因而两组均获得较多数量心肌细胞。在相关研究报道[5-7]中获得心肌细胞存活率约在80%～90%左右不等，但文献报道消化方法参差不齐，有的则较为繁琐，而本试验中通过前期基础上进行改良，改良试验组获取心肌细胞存活率达91.87%，改良试验组获得的心肌細胞存活率较其他研究报道的细胞存活率略有提高，而心肌组织的消化方法相比则更为简便。在该研究中对照组获取细胞即刻存活率仅68.07%，与改良试验组比较差异有统计学意义，为何两组采用相同的混合消化酶消化心肌组织，但试验组细胞存活率明显高于对照组，考虑与胰酶消化时间明显相关。试验组采用5 mL 0.05%I型胶原酶+0.1%Ⅱ型胶原酶混合液消化15 min（共2次），而后加入5 mL 0.125%胰酶快速消化剩余组织5 min的消化次序，这样先把心肌组织团块较长时间置于温和而对心肌细胞损伤极小的混合胶原酶中充分消化解离，把心肌团块消化解离成松散的心肌组织，而后迅速置于消化作用强而对细胞损伤相对较大的胰酶中快速消化，采用此种消化方法可缩短心肌组织和细胞损伤较强的胰酶消化液接触时间，因而获取细胞存活率高，而对照组予加入5 mL的0.125%胰酶+0.05%I型胶原酶+0.1%Ⅱ型胶原酶混合液，每次消化作用10 min，共消化6～7次，采用此种消化方法，虽然亦可比较充分消化心肌组织，但心肌细胞和胰酶消化液总的接触时间较长，而胰蛋白酶对细胞膜有较大破坏作用，时间过长容易过度消化损伤心肌细胞膜，导致细胞坏死。心肌细胞原代培的影响因素众多[8-9]，笔者经过反复实践证实消化酶的选择及消化方法是心肌细胞分离培养最关键重要因素。传统消化心肌细胞最常用的是胰蛋白酶，其分解细胞的组织间质蛋白，然而其对细胞膜有较大损伤，假如浓度太高或消化时间太长则容易过度消化心肌细胞，损伤心肌细胞的细胞膜，使得心肌细胞丧失贴壁能力及心肌搏动活力，此外心肌组织有很多胶原成分，单独应用胰蛋白酶消化心肌组织没有办法充分解离出多的单个细胞。而组织胶原酶，可分解细胞之间的胶原成分，本身对心肌细胞的损伤很小，把成团的心肌组织块分解成松散单个细胞很有好处，然而其温和的分解作用，势必导致消化组织需要耗时大量时间，此外，由于心肌组织间质胶原具有多种类型，应用某一种胶原酶效果亦有限，基于此，笔者采用了0.125%胰酶+0.05%I型胶原酶+0.1%Ⅱ型胶原酶联合消化方法，简单快捷的分离出良好的心肌细胞，用此法培养的心肌细胞可以满足各种体外试验的要求。

[参考文献]

[1]  曹亚斌，钟栩.心肌细胞培养研究进展[J].中医临床研究， 2016，8（35）：145-148.

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[3]  吴丹，冯健，莫显刚，等.改良的乳小鼠心肌细胞原代培养方法[J].中国比较医学杂志，2016，26（4）：62-67.

[4]  刘博，刘小雷，潘桂兰，等.乳鼠心肌细胞的原代培养方法改良[J].中南药学，2017，15（1）：18-21.

[5]  蒋学友，张丽，俞晨，等.SD乳鼠心肌细胞原代培养及纯化方法的优化探索[J].四川大学学报医学版，2015，46（2）： 301-304.

[6]  黄绍代，陈鹏，吴超，等.乳鼠心肌细胞可成片生长的分离和培养方法[J].中国组织工程研究，2017，21（24）：3875-3880.

[7]  付微，刘飞，乔陆明，等.新生SD大鼠心肌细胞分离培养及纯化的快速便捷方法及鉴定[J].牡丹江医学院学报，2017，38（5）：6-8.

[8]  Simpson， P and Savion S.Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations， ultrastructure， and chronotropic response to isoproterenol[J].Circ Res， 1982，50（1）： 101-116.

[9]  王佳南，张晓刚，汤为学，等.新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良[J].重庆医科大学学报，2009，34（5）：600-603.

（收稿日期：2018-08-25）