郭文静++蒋薇薇++郑春光++何万里

摘 要：目的：建立稳定的分离、纯化新生昆明乳鼠心肌细胞的培养方法。方法：用含EDTA的0.125%胰蛋白酶消化1～2d内的新生昆明乳鼠心肌组织，得到的细胞悬液经过滤、差速贴壁、5-溴尿嘧啶相结合的方式纯化后在含20%胎牛血清DMEM新鲜培养基中培养。结果：14h后心肌细胞贴壁，呈圆形；48h后呈梭形，规律性搏动。结论：本研究应用的方法可以获得成活率高、生长状态良好的新生昆明小鼠心肌细胞，是一种稳定的心肌细胞培养方法。

关键词：乳鼠；心肌细胞；原代培养

中图分类号：R-322 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）06-0206-01

心肌细胞培养已成为研究心血管疾病发病机制的重要手段，稳定的心肌細胞适于各种研究，已有的研究报道多采用新生大鼠心肌细胞进行体外培养[1]，小鼠心肌细胞的原代培养因分离困难及生长状态欠佳等原因报道较少，故本实验在前人研究的基础上[2]摸索新生昆明乳鼠心肌细胞的原代培养方法，最终建立了稳定的小鼠心肌细胞体外培养方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验所用动物由河南省实验动物中心提供，新生1～2d昆明小鼠乳鼠，雌雄不限。

1.2 新生昆明乳鼠的心肌细胞培养

1.2.1 取心肌组织

（1）在超净工作台外，将9只1-2日龄的新生昆明乳鼠埋入碎冰15s低温麻醉；

（2）麻醉乳鼠放置超净工作台，75%的酒精擦拭消毒；

（3）无菌眼科剪在乳鼠胸腹部略左剪开，切口约1cm，暴露心脏，舒张期取心肌；

（4）剪下的心肌通过无菌PBS反复冲洗3次。

1.2.2 消化心肌组织

（1）眼科剪将漂洗过的组织剪碎至1mm3；

（2）将剪碎小块置于含转子的无菌小瓶，加0.125%含EDTA的胰蛋白酶（gibco）约4mL，恒温磁力搅拌器里37℃低速消化15min；重复以上操作4次，吸取上清液于含有胎牛血清的无菌离心管中终止消化，血清和酶溶液之比为1：10；

（3）收集的细胞悬液1000rpm离心5min；弃上清，37℃水浴过的含20%胎牛血清（HYCLONE）、80%DMEM/F-12（80%DMEM/F-12）的新鲜培养基重悬细胞；

（4）200目不锈钢滤网过滤细胞悬液。

1.2.3 心肌组织的铺板、换液

（1）经滤过的细胞悬液接种于六孔板，37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育90min，通过差速贴壁，初步分离贴壁快的成纤维细胞和贴壁慢的心肌细胞；

（2）孵育后的培养液上清（大部分都是心肌细胞）种入24孔板的三个孔中，加5-溴尿嘧啶（sigma），终浓度为0.1mmol，37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

（3）36h后更换新鲜培养基，倒置显微镜下观察心肌细胞生长状况。

2 结果

根据短时间多次消化的原则将心肌组织分离成单个的心肌细胞，并通过差速贴壁的物理方法和5-溴尿嘧啶杀成纤维细胞的化学方法相结合纯化心肌细胞，纯化后的心肌细胞铺板，24h后更换新鲜培养基，36-48h间观察细胞生长情况（图1）。倒置显微镜下观察未贴壁的心肌细胞细胞呈圆形或椭圆形，1-2h后贴壁生长，逐渐成梭形，多角形。一般数小时后即能出现自发性搏动，培养2-3d可长成单层并形成细胞簇，可观察到培养的心肌细胞出现同步搏动。

3 讨论

高效的心肌细胞培养是组织工程心血管相关研究的前提。新生小鼠在3d内其心肌细胞都有增值能力，出生后时间越短其心肌细胞分离成活率越高，越易贴壁生长。本实验在前人方法学的基础上加以改进，为了获取更多有活性的心肌细胞，选择在磁力搅拌器的帮助下多次短时间消化心肌组织；并通过200目滤网过滤、差速贴壁和5-溴尿嘧啶等方法纯化心肌细胞。通过本研究可以建立稳定的心肌细胞培养方法。

参考文献

[1]Piper HM Jacobson SL， Schwartz P Determinants of cardiomyocyte development in long term primary culture[J].J M o l Cardiac.1988 20（9）：825-835.

[2]彭双清，杨进生.镰刀菌毒素对心肌细胞膜电位的影响和硒的保护效应[J].中华预防医学杂志，2003，37（6）：423-425.