红花黄色素对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR缝隙连接蛋白Cx43的影响※

童彩玲杨瑞仪1黄梅陆慧敏

(广州中医药大学第一附属医院乳腺科，广东广州510405)

【摘要】目的观察红花黄色素对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR缝隙连接蛋白Cx43的影响。方法取对数生长期的MCF-7/ADR细胞，以2×10`5cells/孔接种于6孔培养板，24 h后分为4组，每组3孔，其中3组分别加入红花黄色素至终浓度25、50、100 mg/L，另一孔设为空白对照组，作用48 h。Western blot法检测各组MCF-7/ADR细胞中Cx43表达水平。结果不同浓度红花黄色素作用于MCF-7/ADR细胞48 h后，Cx43表达水平均增高，有明显的剂量依赖关系，以50、100 mg/L浓度作用显著(P<0.01)。结论红花黄色素能提高乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR缝隙连接蛋白Cx43的表达水平。

【关键词】红花；乳腺肿瘤；连接蛋白43；药理作用；药物筛选试验，抗肿瘤

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2015.05.030

【中图分类号】R286.91；R737.9；R977.6；R73-354；R285.5

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2015)05-0725-03

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of Safflower yellow on gap junction protein Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR.MethodsMCF-7/ADR cells of logarithmic growth phase were inoculated in six-well culture dishes (2×10`5 cells each hole)，and divided into 4 groups after 24 hours，3 holes in each group.3 groups were added Safflower yellow to the final concentration of 25，50，100 mg/L，respectively.The last group was blank control group.48 h after cultivating，the expression level of Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR were detected by Western-blot.Results48 h after different concentration of Safflower yellow acted on MCF-7/ADR cells，the expression level of Cx43 was increased in a dose-dependent relationship and there were remarkable effects on the concentration of 50，100 mg/L (P<0.01).ConclusionSafflower yellow can improve the expression level of gap junction protein Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR.

作者简介：童彩玲(1975—)，女，副主任中医师，博士。研究方向：中西医结合治疗乳房疾病。

收稿日期：(2014-05-08)

Effects of Safflower yellow on gap junction protein Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADRTONGCailing*，YANGRuiyi，HUANGMei，etal.*DepartmentofGalactophore，theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，Guangdong，Guangzhou510405

【Key words】 Safflower; Breast tumor; Cx43; Pharmacologic action; Drug screening test; Anti-tumor

※项目来源：2012年度广东省自然科学基金博士启动项目(编号：S2012040006689)

1广州中医药大学热带医学研究所，广东广州510405

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，化疗是乳腺癌治疗的重要手段，以往对提高化疗药物疗效的研究多从逆转化疗药物的多药耐药入手。近年来研究发现，可通过增强肿瘤细胞的缝隙连接(gap junction，GJ)功能，来增强化疗药物的细胞毒性[1]，为肿瘤治疗开辟了新途径。

GJ是细胞间进行物质交换的主要连接通道，由特殊的通道蛋白—连接蛋白(Connexin，Cx)组成。乳腺癌各种细胞株中GJ功能存在不同程度的降低或缺失，提高GJ功能可显著增强阿霉素对乳腺癌的抗肿瘤作用[2]。本课题组前期研究发现，红花黄色素能上调心肌连接蛋白Cx43水平，对阿霉素心肌损伤具有一定的心脏保护作用[3]。本实验研究旨在探讨红花黄色素对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR缝隙连接蛋白Cx43的影响，结果如下。

1材料与方法

1.1药物及试剂人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADR(深圳市百恩维生物科技有限公司)；阿霉素(深圳万乐药业有限公司，批号1212E1)；红花黄色素(山西华辉凯德制药有限公司，批号201302035)。DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)。Cx43兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗、β-actin鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗(美国PTG公司)。Western及免疫沉淀(IP)细胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、一抗二抗去除液(上海碧云天生物科技有限公司)。增强化学发光(ECL)试剂盒(广州美津生物技术有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养将MCF-7/ADR接种于DMEM高糖培养液，内含10%胎牛血清、100 g/mL链霉素、100 U/mL青霉素、1 μg/mL阿霉素，37 ℃、5%CO2培养。2~3 d后细胞融合达到80%~90%时1∶2或1∶3传代培养。

1.2.2红花黄色素处理取对数生长期的MCF-7/ADR细胞以2×105cells/孔接种于6孔培养板，24 h后分为4组，每组3孔，其中3组分别加入红花黄色素至终浓度25、50、100 mg/L，作用48 h另1组设为空白对照组，术进行任何处理。

1.2.3Western blot法检测Cx43蛋白表达吸去各组细胞培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞2遍后，用Western及IP细胞裂解液充分裂解，离心收集上清液，BCA法测定总蛋白浓度。取相同浓度的蛋白液进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，将分离的蛋白转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，加入1∶2 500稀释的Cx43兔单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入1∶8 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜，与化学发光试剂ECL于暗室中进行反应，待胶片爆光，专业图像分析显影定影，扫描图像，采用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件分析条带密度。PVDF膜用一抗二抗去除液洗膜去掉抗体，按上述方法重新封闭，加入1∶8 000稀释的β-actin鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗进行二次杂交，ECL显色，扫描图像，以作为内参对照。

1.3统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行统计学显著性分析。

2结果

4组人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADR Cx43蛋白表达比较见图1、2。

图1　4组人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADR Cx43蛋白表达 注：1为空白对照组；2为红花黄色素25 mg/L组；3为红花黄色素50 mg/L组；4为红花黄色素100 mg/L组

图2　4组人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADR Cx43蛋白表达比较 与空白对照组比较，** P<0.01

Western blot结果采用Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件进行定量分析，灰度值以累积吸光度值表示，结果以Cx43与β-actin的累积吸光度比值表示。由图1、2可见，不同浓度红花黄色素作用于MCF-7/ADR细胞48 h后，Cx43蛋白表达水平增高，有明显的剂量依赖关系，以50、100 mg/L浓度作用显著(P<0.01)。

3讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，以阿霉素为代表的蒽环类药物在乳腺癌化疗方案中有着举足轻重的地位。但肿瘤细胞对阿霉素产生的耐药及其心脏毒性，直接影响了其疗效和广泛使用。临床研究发现，在阿霉素化疗时加用红花注射液可以预防和减轻阿霉素引起的急性心脏毒性，提高患者对阿霉素化疗的耐受性和依从性[4-5]。实验研究表明，红花黄素不仅能上调心肌连接蛋白Cx43水平，对阿霉素心肌损伤具有一定的保护作用[3]，而且对肿瘤细胞有较强的抑制作用[6]。

缝隙连接(GJ)是位于细胞膜上的一种特殊细胞连接，生物体内相邻细胞间主要通过GJ通道互相传递信号分子，从而控制细胞间的协调生长。近年来，GJ已成为较为公认的肿瘤抑制基因，GJ介导的细胞间通讯功能可抑制肿瘤的发生和转移[7]。GJ由特殊的通道蛋白—Cx组成，Cx是进行细胞间通讯的物质基础，广泛存在于心脏、肝脏、肌肉和皮肤等。目前在乳腺组织中检测出Cx26、Cx32和Cx43 3种Cxs表达，其中又以Cx26和Cx43表达为主。有研究发现，在Hela细胞，Cx26/Cx32组成的GJ能增强顺铂的细胞毒性。顺铂能够通过直接作用于Cx抑制GJ的通透性而降低顺铂的细胞毒性，这可能是其耐药性产生的一种机制[8]。因此，Cx不失为一种逆转化疗耐药的治疗靶点，寻求能增强乳腺癌细胞Cx43表达的药物，对提高阿霉素的抗肿瘤作用具有十分重要的意义。红花黄色素是从活血化瘀中药红花中提取的有效成分之一。本研究结果显示，红花黄色素能使乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的缝隙连接蛋白Cx43表达水平增高，且有明显的剂量依赖关系，为中医药在逆转化疗耐药方面提供了新的研究思路。

参考文献

[1]齐晓艳，张波，余美玲，等.三七皂苷R1通过细胞缝隙连接对顺铂细胞毒性作用的影响[J].蚌埠医学院学报，2012，37(2)：134-136，141.

[2]蒋国君，童旭辉，祝晓光，等.在Hs578T乳腺癌细胞由Cx43组成的细胞缝隙连接对阿霉素细胞毒性的影响[J].中国药理学通报，2012，28(5)：641-647.

[3]童彩玲，刘金元，黄梅，等.红花黄色素对阿霉素心肌损伤小鼠缝隙连接蛋白的影响[J].广州中医药大学学报，2014，31(2)：272-274，323.

[4]江英强，宋高平，郑连喜，等.红花注射液防治阿霉素相关性心脏毒性的临床研究[J].现代中西医结合杂志，2010，19(25)：3146-3147.

[5]刘意.红花黄色素注射液防治阿霉素相关性心脏毒性的临床观察[J].中国社区医师，2008，24 (23):23.

[6]牛旭艳，张前，任玲，等.羟基红花黄色素A对移植性H22小鼠肿瘤的抑制作用[J].中华中医药杂志，2006(增刊)：177-178.

[7]范高福，童旭辉，陶亮.缝隙连接：一个潜在的肿瘤治疗新靶点[J].蚌埠医学院学报，2012，37(2)：234-237.

[8]由天辉.顺铂对细胞缝隙连接的作用与其耐药性产生关系的研究[D].广州：中山大学，2007.

(本文编辑：曹志娟)