王 斌 ，袁定胜 ，李金良 ，李思聪 ，李旭廷 *

（1.四川省畜牧科学研究院兽药研究所，四川 成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066）

肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）是一类定植于肠道外组织并引起严重感染的大肠杆菌。临床上可引起人的泌尿系统感染、新生儿脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎，家禽的腹膜炎、肉芽肿及猪的败血症、肺炎、脑膜炎[1-3]。为了解四川地区猪源ExPEC的流行情况，笔者对一些临床病死猪进行了ExPEC的分离鉴定，同时进行了药敏实验，为猪源ExPEC的防控及药物治疗提供实验室依据。

1 材料

1.1 样本采集 从四川地区多个猪场采集病死猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结、血液作为病料样本，置无菌样品袋中，冰盒保存，12h内送实验室进行细菌分离。

1.2 试剂、培养基和标准菌株 麦康凯琼脂、营养肉汤、MH琼脂、普通营养琼脂、药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司；标准菌株：大肠杆菌标准株（ATCC 25922）购自中国兽药监察所。

1.3 实验动物 昆明系SPF小鼠，购自四川达硕生物技术有限公司。

2 方法

2.1 病料接种 无菌切取病变组织和正常组织交界处的小组织块置肉汤培养基中，37℃下进行24 h增菌培养。然后蘸取增菌液划线于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上，37℃纯化培养24h。

2.2 菌落形态特征观察 伊红美蓝琼脂上出现黑色、棕绿色且带有金属反光的菌落或中心黑点边缘呈灰白色的表面光滑的菌落，麦康凯琼脂上出现典型红色、粉红色的光滑菌落；1000×油镜下检测为革兰氏阴性杆菌。符合以上特征的基本判定为大肠杆菌，然后可作进一步的分子鉴定。

2.3 16S rDNA PCR测序鉴定[4]从伊红美蓝琼脂或麦康凯琼脂上挑取纯化后的典型单个菌落进行PCR实验，扩增细菌16S rDNA基因。引物为通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件：95℃ 5 min，95℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 2 min（30次循环），72℃ 8min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，预扩增片段1450bp。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序，序列结果用NCBI BLAST搜索比对，鉴定标准按照同源性≥97%判定。

2.4 致病性实验[5]将鉴定了的ExPEC接种到MH琼脂平板，经37℃ 24h纯培养，然后用灭菌生理盐水洗下菌液，调整浑浊度与0.5麦氏比浊管（1×108cfu/mL）相当，再分别腹腔注射小白鼠（0.2mL/只），每株菌同时接种3只小鼠，并设标准株ATCC 25922为对照，观察分离菌株对小鼠的致病性。

2.5 药敏实验 根据CLSI（2009）推荐的K-B法检测分离菌对12种抗菌药的耐药性。将纯化后的菌落用灭菌生理盐水制成悬液，调整菌液浑浊度与0.5麦氏比浊管相当。用固定大小的无菌棉拭子蘸取菌悬液，在MH琼脂平板上均匀涂抹接种，以大肠杆菌标准株ATCC 25922作药敏实验质控菌。

3 结果

3.1 细菌分离 从52个猪场采集的210个病料组织中，分离到了麦康凯琼脂上形态为典型的红色、光滑、圆形或水滴状菌落，伊红美兰琼脂上呈黑色或棕绿色有金属反光的光滑菌落。经16S rDNA PCR鉴定，得出ExPEC共40株，分离率达19.1%。各个脏器的分离率分别为肺脏32.5%（13/40），淋巴结22.5%（9/40），肝脏 10%（4/40），心脏 7.5%（3/40），脾脏7.5%（3/40），肾脏 5.0%（2/40），血液 15.0%（6/40）。

3.2 致病性实验 40株ExPEC攻毒小鼠后，有10株导致1只小鼠死亡，18株导致2只小鼠死亡，12株导致3只小鼠死亡，平均致死率为68.3%。引起至少2只小鼠死亡的30株菌中，有26株引起小鼠死亡的时间不超过18h。从死亡小鼠的肺脏、肝脏等器官中也分离到了同种菌。对照组无死亡。

3.3 药敏实验 40株ExPEC中，34株表现为耐6种受试药物以上的多重耐药；对四环素、氨苄西林和卡那霉素耐药严重，耐药率大于80%；对氨苄西林/舒巴坦、阿米卡星、头孢克肟保持较高的敏感性，耐药率小于20%。药敏实验结果见表1。

4 讨论

4.1 本试验所采样的病死猪来源于四川地区不同规模的猪场，发病猪至少包含以下症状（高热、咳喘、关节肿大、皮肤发红、败血症、脑膜炎）之一。在临床诊断、病理诊断及实验室诊断中发现，几乎所有病例都检测到两种以上的病原菌混合感染，常见的有链球菌、巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌，说明临床上猪病的感染以多重感染为主。本试验中ExPEC的分离率为19.1%，与曾博等报道的“2008～2011年西南地区猪源ExPEC的分离率为18.5%”相似[6]，表明猪源ExPEC在四川地区的流行情况近年比较稳定。试验数据还显示，ExPEC在病死猪肺脏里的分离比例最高（32.5%），与徐引弟等[7]报道的一致。

表1 ExPEC临床分离株的耐药性检测

4.2 本次药敏实验结果表明，40株ExPEC分离株对四环素、氨苄西林和卡那霉素的耐药性最强，最可能的原因是这些药物在兽医临床上已应用多年，是长时间选择压力下筛选的必然结果。分离株对氨苄西林/舒巴坦、阿米卡星、头孢克肟表现出相对较好的敏感性，与曾博等报道的结果一致[6]，可能是因为这三种药物在我国还未批准用于兽医临床，因而不存在药物选择压力，耐药性较小。

4.3 本试验表明，四川地区猪源ExPEC有一定的流行，肺脏分离率最高，且多具有较强的致病性和多药耐药性。临床上预防和治疗猪ExPEC感染，推荐使用和头孢克肟一样同为第三代头孢的动物专用药——头孢噻呋或β-内酰胺酶抑制剂的复方制剂——阿莫西林/克拉维酸。

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[4]Wilson K H，Blitchington R B，Greene R C.Amplification ofbacterial16S ribosomalDNA with polymerase chain reaction[J].J Clin Microbiol，1990，28:1942-1946.

[5]Johnson J R，Clermont O，Menard M，et al.Experimental mouse lethality of Escherichia coli isolates， in relation to accessory traits， phylogenetic group， and ecological source[J].J Infect Dis，2006，194:1141-1150.

[6]曾博，王红宁，邹立扣，等.西南地区猪肠外大肠杆菌毒力基因检测及耐药性研究[J].中国预防兽医学报，2013，35（2）:126-129.

[7]徐引弟，王治方，朱文豪，等.猪肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验[J].河南农业科学，2011，40（1）:150-153.