马晨芸，王克翔

上海市第七人民医院医学检验科，上海200137

慢性丙型病毒性肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染的世界范围内疾病，其显著临床特点是85% ～90%的急性患者将转变为慢性持续性感染［1-2］。研究证实，HCV 具有直接的致细胞病变作用，其致病机制与宿主的免疫反应有密切关系，其中T 淋巴细胞及其所分泌的细胞因子变化显著影响了HCV 感染的进程［3-4］。本文深入探讨了外周血T 淋巴细胞亚群和血清中HCV RNA 复制载量水平之间的关系，旨在阐释CHC 发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012 年1 月-2014 年1 月上海市第七人民医院收治的65 例CHC 患者，男25 例，女40例;年龄34 ～72 岁，平均年龄(42.9 ±15.8)岁。入选标准:符合2011 年《丙型肝炎防治指南》的诊断标准［5］;血清丙氨酸转氨酶(ALT)反复升高;血清HCV RNA(RTPCR 法)和/或抗-HCV(ELISA 法)阳性;近6 个月内无免疫调节剂应用史。排除标准:合并有其他病毒性肝炎、自身免疫性疾病等严重性疾病;近6 个月内应用免疫调节剂。患者按HCV RNA 载量水平分为高载量组(HCV RNA ＞1 ×105/ml)、中载量组(1 ×103～1 ×105copies/ml)、低载量组(＜1 ×103copies/ml)。选取健康体检者25 名作为对照组，男10 名，女15 名，年龄32 ～74 岁，平均年龄(43.2 ±16.2)岁。两组年龄和性别比例相比，差异无统计学意义(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂:流式细胞仪为美国BD 公司生产的FACSCantoTMⅡ型，PCR 仪为Hema 9600 基因扩增仪;CD3/CD4/CD8 荧光标记单克隆抗体及红细胞裂解液由上海杰一生物有限公司提供，HCV 核酸定量试剂盒由凯杰生物工程(深圳)有限公司提供。

1.2.2 HCV RNA 载量检测:按操作步骤，采用实时荧光定量PCR 检测HCV RNA。

1.2.3 流式细胞仪检测T 细胞亚群:取所有患者及健康体检者外周静脉血1 ml，及时加入抗凝剂。取100 μl 抗凝静脉血，加入10 μl 荧光标记的单克隆抗体CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE，混匀后室温下避光孵育15 min。加入红细胞裂解液250 μl 裂解20 min，离心(1 200 r/min，5 min)，弃去上清液，PBS 洗涤2次，PBS 悬浮细胞，流式细胞仪检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0 统计软件进行分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用s 表示，并行t 检验。相关性分析采用Spearman 等级相关分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T 细胞亚群分布 流式细胞检测法测定CHC 患者和健康体检者T 细胞亚群分布。CD3+T 细胞亚群在两组人群中分布相比，差异无统计学意义(P ＞0.05);CD4+T 细胞亚群在CHC 患者中分布明显低于健康体检者(P ＜0.05)，CD8+T 细胞亚群在CHC 患者中分布明显高于健康体检者(P ＜0.05，见表1)。

表1 两组T 细胞亚群分布比较(s)Tab 1 Comparison of T cells distribution between two groups (s)

表1 两组T 细胞亚群分布比较(s)Tab 1 Comparison of T cells distribution between two groups (s)

组别 CD3 +(%) CD4 +(%) CD8 +(%) CD4 + /CD8+健康体检者 77.95 ±10.45 45.34 ±7.10 25.44 ±6.17 1.93 ±0.56 CHC 患者 76.45 ±9.43 41.17 ±5.41 31.45 ±9.02 1.62 ±0.88 P 值0.432 0.001 0.000 0.012

2.2 HCV RNA 载量与T 细胞亚群分布的相关性分析 CD3+T 细胞亚群百分率与HCV 复制程度之间无明显相关性(r=0.025，P =0.421);CD4+T 细胞亚群百分率与HCV 复制程度之间有明显相关性(r =0.783，P=0.002)，随着HCV 复制程度增加，CD4+T细胞亚群百分率逐渐降低;CD8+T 细胞亚群百分率与HCV 复制程度之间有明显相关性(r = 0. 942，P =0.000)，随着HCV 复制程度增加，CD8+T 细胞亚群百分率逐渐升高;CD4+/CD8+比值与HCV 复制程度之间有明显相关性(r =0.682，P =0.005)，随着HCV 复制程度增加，其比值逐渐降低(见表2)。

表2 不同HCV RNA 载量人群T 细胞亚群分布(s)Tab 2 T cell subsets distribution of different HCV RNA load crowd (s)

表2 不同HCV RNA 载量人群T 细胞亚群分布(s)Tab 2 T cell subsets distribution of different HCV RNA load crowd (s)

组别 例数 CD3 +(%) CD4 +(%) CD8 +(%) CD4 + /CD8+51中载量组 22 75.89 ±4.24 42.22 ±6.24 31.46 ±5.76 1.32 ±0.18低载量组 23 77.01 ±9.31 43.28 ±4.07 27.34 ±4.99 1.64 ±0.27健康体检组 20 77.95 ±10.45 45.34 ±7.10 25.44 ±6.17 1.93 ±0.56 r 值高载量组 20 76.04 ±8.02 38.02 ±5.92 38.93 ±3.66 1.04 ±0.0.025 0.783 0.942 0.682 P 值0.421 0.002 0.000 0.005

3 讨论

HCV 感染能引起慢性病毒性肝炎、肿硬化、肝细胞癌，严重影响感染者的生活质量和身体健康。HCV主要由血液/体液传播，随着检测技术的不断进步，自然人群、献血者HCV 阳性检出率呈升高趋势，可能与血制品的广泛应用、器官移植的兴起和人们生活方式的改变等因素相关［6］。调查显示，全球有1.7 亿人感染HCV，我国普通人群抗HCV 阳性率为3. 2%［5］。HCV 感染引起脂肪肝与病毒感染、肥胖、高脂血症等因素密切相关。其中HCV 感染引起的慢性肝炎主要引起胆管损伤、肝内门静脉旁淋巴细胞浸润或淋巴滤泡聚集、肝细胞脂肪变性和坏死［7］。

细胞免疫作为人体免疫系统中的重要组成部分，通过调节T 淋巴细胞各亚群的比例维持人体免疫内环境的稳定，越来越多的疾病被证实与T 淋巴细胞亚群的变化密切相关［8］。T 淋巴细胞的数量及比例在一定程度上反映了机体的免疫水平，机体正常免疫状态下各T 淋巴细胞亚群之间相互协调制约，维持机体的正常免疫状态，一旦T 淋巴细胞亚群的数量级比例发生变化，机体的免疫功能出现紊乱［9］。研究显示，在HCV 的病理生理中，宿主细胞免疫应答是决定病情发展的关键因素之一［10］。机体本身的代偿能力使得HCV 感染并不能引起机体血清变化，HCV 感染造成的免疫功能紊乱才是造成肝损伤的直接因素。T 淋巴细胞各亚群各司其职，CD3+T 细胞和CD4+T 细胞的主要作用是辅助和诱导免疫应答、活化巨噬细胞，同时还具有分泌淋巴因子、启动迟发性超敏反应的作用。除此之外，CD4+T 细胞还能促进免疫细胞的增殖及分化，调节体液免疫和细胞免疫，维持机体的正常细胞免疫功能［5］。由于CHC 患者缺乏有效的中和抗体，所以机体的细胞免疫功能对清除体内HCV 十分关键，但大多数CHC 患者的细胞免疫功能受到不同程度的损害。本研究显示，CD3+T 细胞亚群在两组人群中分布，差异无统计学意义;CD4+T 细胞亚群和CD4+/CD8+在CHC 患者中分布明显低于健康体检者，CD8+T 细胞亚群在CHC 患者中分布明显高于健康体检者。因此，CHC 慢性化的主要原因可能是HCV 感染所致T 细胞各亚群的比例变化，提示细胞免疫可能是HCV 发病的主要机制。此外，不同HCV RNA载量与外周血T 淋巴细胞的相关性分析显示，CD3+T细胞亚群百分率与HCV 复制程度之间无明显相关性，CD4+T 细胞亚群、CD8+T 细胞亚群百分率和CD4+/CD8+比值与HCV 复制程度之间有明显相关性，表明HCV 感染所致机体免疫功能的改变首先反映在CD4+/CD8+比值下降，CD4+/CD8+比值下降可能与HCV 存在和复制相关。

综上所述，CHC 患者HCV 感染慢性化与外周血T淋巴细胞亚群比例之间存在密切相关性。HCV RNA复制程度增加进一步导致T 细胞亚群的紊乱，CD4+/CD8+比值的动态变化可提示HCV 感染者细胞免疫功能的变化。

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