李珍杰，李建生，张金平，保 洁，李东颖

郑州大学第一附属医院消化科，河南 郑州450052

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国常见的恶性肿瘤，其恶性程度高，总体预后较差［1］。HCC 预后差主要与其富有血管并有较强的侵袭性有关。上皮-间充质转变(epishelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞失去其特点获得间充质细胞表型的细胞骨架重塑过程。EMT 过程包括:上皮细胞失去极性、细胞与细胞黏附性降低、细胞骨架的重塑，最终获得迁移表型。EMT 主要分子特征为上皮细胞标志物表达水平的下调和间质细胞标志物表达水平的上调［2］。已有研究表明EMT 与多种肿瘤的预后及转移有关［3-4］。但目前的研究主要集中在EMT 导致的肿瘤侵袭转移方面，而参与血管生成的研究报道极少。基于此，我们应用免疫组织化学技术从蛋白质水平检测人HCC 中血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)、E-cadllerin 的表达，分析其与HCC 的侵袭、转移及预后关系，初步探讨VM 形成的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集郑州大学第一附属医院2000 年1 月-2009 年6 月经手术切除、临床病理资料及预后资料完整的HCC 患者200 例，男164 例，女36 例，年龄20 ～78 岁，平均年龄(49 ±12.56)岁;其中病理学分期Ⅰ、Ⅱ期患者79 例，Ⅲ、Ⅳ期患者121 例;肿瘤大小≤5 cm 者103 例，＞5 cm 者97 例;术后复发转移105 例，无复发转移95 例。所有患者术前均未行介入、化疗等辅助治疗，随访时间截止到2013 年5 月。200 例HCC 患者的一般情况如表1 所示。

1.2 方法

1.2.1 实验试剂:兔抗人单克隆抗体CD31、PAS 染色液购自美国Santa Cruz 公司。兔抗人E-cadherien 抗体购自北京中杉生物技术公司。

1.2.2 免疫组化染色:CD31/PAS 双重染色方法，石蜡切片常规脱蜡水化后，按照SP 法操作，进行CD31免疫组化染色，DAB 染色至血管内皮细胞着色后，终止反应。过碘酸溶液中氧化，再行PAS 染色。

E-cadherien 免疫组化染色及结果判断:石蜡切片脱蜡水化，高温抗原修复，加兔抗人E-cadherien 抗体(1∶100)，按照SP 免疫组化试剂盒要求操作。DAB 显色，苏木素复染，中性树脂封固。结果判定参照Mattem 积分法，即阳性细胞百分率:每例标本选择10 个含有阳性细胞的高倍视野，0 为无阳性细胞;1 为阳性细胞≤25%;2 为阳性细胞≤50%;3 为阳性细胞＞50%。染色强度:0 为阴性;1 为浅黄色;2 为深黄色;3为棕黄色。染色指数为二者之和。阳性表达指数＞3定为免疫组化染色阳性;≤3 定为阴性。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件包进行统计学分析，分类资料采用χ2检验，相关分析采用Pearson 相关分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 组织中VM 情况 200 例HCC 组织中38例存在VM，阳性率为19.0%。CD31/PAS 双重染色可见一层PAS 阳性物质围成基底膜样结构(见图1)。VM 的表达与肿瘤患者的性别、年龄无关(P ＞0.05)。与肿瘤的大小、病理学分期、术后复发与转移及TNM分期有关(P ＜0.05，见表1)。

表1 HCC 患者临床病理特征与VM、E-cadherien 表达的关系Tab 1 The relationship of VM，E-cadherien expression and clinical pathological characteristics

2.2 HCC 组织中E-cadherien 的表达情况 HCC 组织中E-cadherien 表达97 例，阳性率为48.5%，表达于细胞膜，阳性产物为棕黄色颗粒，其表达与肿瘤的大小、病理学分期、TNM 分期、术后复发与转移有关(P ＜0.05)。而与患者的性别、年龄无关(P ＞0.05，见表1、图2 ～3)。

2.3 VM 阳性表达与E-cadherien 表达关系 Pearson 相关性分析显示:VM 的表达与E-cadherien 的表达呈负相关，差异有统计学意义(P=0.02，见表2)。

表2 VM 与E-cadherien 的关系Tab 2 The relationship between VM and E-cadherien

图1 CD31/PAS 染色VM 的表达(200 ×)(黑色箭头所指为血管，红色箭头所指为VM);图2 VM 阴性组E-cadherien 的阳性表达(400 ×);图3 VM 阳性组E-cadherien 的阴性表达(400 ×)Fig 1 VM expression was identified by CD31/PAS double-staining (200 ×);Fig 2 Negative VM with positive E-cadherin expression (400 ×);Fig 3 Positive VM with negative E-cadherin expression (400 ×)

3 讨论

肿瘤的生长依赖血管生成［5］。经典的血管生成途径为血管发生及血管再生。经典的肿瘤血管生成理论认为:当肿瘤直径＞2 mm 时，需要构建血管获取血供，否则肿瘤就会因为缺血缺氧发生坏死。但在1999年，美国Maniotis 根据对人眼葡萄膜黑色素瘤微循环的研究，首次提出了一种与经典的肿瘤血管生成途径完全不同、不依赖机体内皮细胞的全新肿瘤微循环模式，即VM 的概念，VM 是指某些高度恶性肿瘤细胞通过自身变形模拟血管内皮细胞并与细胞外基质相互作用，模仿血管壁结构形成可以运输血液(血浆、红细胞)的管道系统，从而重塑肿瘤微循环，并与宿主血管相连使肿瘤获得血液供应的一种现象。研究报道，在多种恶性肿瘤组织均存在VM［6］。并有研究证实肝癌中存在VM［7］，其与病理学分期及预后有关。但VM形成的机制及调控因素研究较少。本研究应用CD31/PAS 双重染色证实HCC 中存在VM。VM 为CD31 染色阴性，PAS 阳性的管状结果，其内可见红细胞。且其多位于肿瘤内部，管道内部很少观察到微血栓，表明其可为肿瘤供血，使肿瘤能够在宿主环境中无坏死性生长。VM 的表达与性别、年龄无关，与分化程度及肝癌的转移有关，且与患者术后5 年生存率有关，阳性率高于高度分化组，说明VM 是HCC 预后不良的危险因素，干扰VM 的形成可能有助于改善HCC 患者预后。

上皮来源的肿瘤细胞可通过EMT 过程失去彼此之间的链接，获得间充质细胞的表型和迁移功能，肿瘤细胞也因此具备侵袭和转移能力，故EMT 被认为在肿瘤的生长和演进中起到了重要作用［8］。E-cadherin 是上皮组织中的一种细胞间跨膜粘连糖蛋白分子，Ecadherin 表达的丢失被认为是EMT 最显著的特征。本研究表明:E-cadherin 的表达与HCC 分期、血管侵犯有关，与相关研究［9］相符。HCC E-cadherin 表达下降，即EMT 的发生可使HCC 细胞间结构松散，细胞更易发生解离，并且增加细胞的运动性，从而使细胞侵入周围组织，促进HCC 的侵袭和转移。其与HCC 术后复发与转移有关，可证实E-cadherien 的高表达可对HCC术后复发、转移有保护作用，E-cadherien 的下调可作为判定HCC 患者预后不良的指标。

研究结果表明，VM 的表达与E-cadherien 的表达有很好的相关性，推测E-cadherien 表达的下调即EMT的发生可能促进VM 的产生。推测肝癌细胞或可通过EMT 过程发生细胞自身的塑形，从而获得构建VM 的能力。抑制E-cadherien 下调表达可能干预VM 形成，为肿瘤的治疗提供新的靶点。

［1］ Zhang SW，Li LD，Lu FZ，et al. Mortality of primary liver cancer in China from 1990 through 1992 ［J］. Chin J Oncol，1999，21(4):245-253.张思维，李连弟，鲁凤珠，等. 中国1990 -1992 年原发性肝癌死亡调查分析［J］. 中华肿瘤杂志，1999，21(4):245-253.

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［4］ Yang J，Weinberg RA. Epithelial-mesenchymal transition:at the crossroads of development and tumor metastasis［J］. Dev Cell，2008，14(6):818-829.

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［9］ Liu Z，Sun B，Qi L，et al. Zinc finger E-box binding homeobox 1 promotes vasculogenic mimicry in colorectal cancer Through induction of epithelial-to-mesenchymal transition［J］. Cancer Sci，2012，103(4):813-820.