奥沙利铂联合地塞米松对肺腺癌A549细胞增殖的影响

李力，邓敏

(湖北省武汉市普仁医院，湖北武汉430081)

摘要：目的：研究奥沙利铂联合地塞米松对肺腺癌A549/DDP细胞及肺腺癌患者外周纯化Th17细胞的影响。方法：使用不同浓度的奥沙利铂(0.3125μg/mL、0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)及地塞米松(1nmoL/L、10nmoL/L、100nmoL/L、200nmoL/L、500nmoL/L、1000nmoL/L)在不同时间点(24h、48h、72h)干预人肺腺癌A49/DDP细胞及Th17细胞，通过细胞增殖抑制实验、细胞凋亡实验检测肺腺癌细胞生长抑制率及细胞凋亡情况，结果：在1nmoL/L～200nmoL/L时地塞米松对肺腺癌A549细胞增殖无抑制作用，500～1000nmoL/L的浓度范围内，地塞米松以剂量依赖性方式抑制肺腺癌A549细胞增殖，并表现出明显的量效关系(r=0.282，P<0.05)；且随着作用时间的延长，抑制率逐渐增加，呈现出浓度和时间依赖性。在0.3125～1.25μg/mL奥沙利铂肺腺癌A549细胞增殖无抑制作用，2.5～10μg/mL奥沙利铂以时间及剂量依赖性对肺腺癌A549细胞的增殖产生抑制作用，当5μg/mL及10μg/mL奥沙利铂作用于肺腺癌A549细胞细胞72h后，抑制率分别为61.12±0.98%、63.67±0.18%，抑制作用相当(P>0.05)。连续给药24h、48h、72h后发现干预24h后即对肺腺癌A549细胞增殖产生抑制作用，联合用药组OD值明显低于单用组，即联合用药其抑制率显著高于其他单用组，且趋势随着用药时间的延长而逐渐明显。结论：地塞米松联合奥沙利铂联合用药能产生协同作用，抑制A549细胞增殖。

关键词：肺腺癌;地塞米松;奥沙利铂;增殖抑制

文章编号：1006-6233(2015)11-1774-04

基金项目：*国家自然科学基金，(编号：Q2007C02)

文献标识码：A

非小细胞肺癌(NSCLC)属于腺癌最常见的肺癌病理类型也是预后最差的恶性肿瘤之一。据临床研究表明NSCLC具有高度异质性，能够抵抗化疗药物的治疗，5年死亡率高达80%[1]。虽然关于NSCLC症的知识不断增多，但有关NSCLC的发病机制仍不明确，仍很难确定肺癌的异质性和耐药性的发病基础。地塞米松属于肾上腺皮质激素类药，具有理想的抗炎、抗过敏和抗毒效应，目前被广泛运用于炎症、哮喘等疾病，并随着肿瘤研究的不断深入，地塞米松逐渐在抗肿瘤领域被推广，有文献显示：地塞米松可以增强肿瘤患者对于化疗的敏感性，从而提高药物的抗肿瘤作用。奥沙利铂作为目前最重要化疗药物之一被频繁地运用于NSCLC的治疗，但其作用机制也众说纷纭。肿瘤细胞的增殖与凋亡之间的平衡趋向决定肿瘤的发生发展。凋亡过程受到机体癌基因与抑癌基因的双重调控，直接参与新陈代谢过程中细胞数目的调节，一旦凋亡受阻将导致肿瘤细胞的过度增殖而引发癌症，因此猜想地塞米松及奥沙利铂发挥抗肿瘤效应是否是通过促进肿瘤细胞凋亡实现的。本研究旨在分析奥沙利铂及地塞米松对肺腺癌A549细胞增殖的影响，汇报如下：

1资料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株:人肺腺癌A549/DDP细胞，由上海生命科学院提供。按照WHO肺癌分型标准及UICC(2009年)新的国际肺癌分期标准分型，将本院2009年1月至2013年1月50例NSCLC患者纳入研究并设为观察组，其中男性23例，女性27例，年龄28～76岁，平均(46±8.2)岁。患者住院前均未接受化疗，同期20例健康体检者设为对照组，其中男性11例，女性9例，年龄27～75岁，平均(45±7.7)岁。两组在年龄、性别等一般情况比较方面无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2药物:奥沙利铂注射液(生产厂家：南京制药厂,规格：20mg/20mL*支,批准文号：国药准字H20030675,生产批号：20110111～20140111)。地塞米松注射液(生产厂家：天津金耀药业有限公司,规格：1mL:1mg*支,批准文号：国药字H120210514)

1.1.3主要试剂和仪器:RPMI 1640和胎牛血清(美国Thermo公司)；佛波酯(PMA)、离子霉素(Ion)、莫能菌素(Mon)、破膜剂、CD4-FITC、IL-17A-APC流式抗体；酶标仪，美国Thermo labsystem公司；BD FACSVerse System，美国BD Biosciences公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养方法:常规复苏肺腺癌A549细胞细胞株，以1640培养基(含10%的胎牛血清)培养于37℃，5%CO2的培养箱，胰酶消化传代一次。

1.2.2细胞抑制率实验:细胞吹打成悬液，密度调整为1×105个/mL，每孔200μL均匀接种于96孔板中，按地塞米松(浓度分别设1nmoL/L、10nmoL/L、100nmoL/L、200nmoL/L、500nmoL/L、1000nmoL/L)、奥沙利铂(浓度分别为0.3125μg/mL、0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)考察各药体外最佳浓度，再根据药物最佳浓度将实验空白组、溶剂组、地塞米松组、奥沙利铂组、地塞米松+奥沙利铂组以脂多糖进行干预，24h后，每孔加入相应药液，37℃5%CO2培养箱继续孵育，24h后每孔加入5g/LMTT 20μL，放入孵箱继续孵育4h，弃上清液，每孔加入DMSO 150μL，震荡10min，用全自动酶标光度仪在490nm波长下读取吸光度A值，记录结果。

2结果

2.1不同浓度的地塞米松在不同时间点对肺腺癌A549细胞增殖的影响:在1nmoL/L～200nmoL/L时地塞米松对肺腺癌A549细胞增殖无抑制作用，500nmoL/L～1000nmoL/L的浓度范围内，地塞米松以剂量依赖性方式抑制肺腺癌A549细胞增殖，并表现出明显的量效关系(r=0.282，P<0.05)；且随着作用时间的延长，抑制率也是逐渐增加，呈现出浓度和时间依赖性。见表1。

表1　不同浓度不同时间点地塞米松(DEX)对A549增殖的影响

2.2不同浓度的奥沙利铂在不同时间点对肺腺癌A549细胞增殖的影响:在0.3125～1.25μg/mL奥沙利铂肺腺癌A549细胞增殖无抑制作用，2.5～10μg/mL奥沙利铂以时间及剂量依赖性对肺腺癌A549细胞的增殖产生抑制作用，当5μg/mL及10μg/mL奥沙利铂作用于肺腺癌A549细胞细胞72h后，抑制率分别为61.12±0.98%、63.67±0.18%，抑制作用相当(P>0.05)。见表2。

表2　不同浓度不同时间点奥沙利铂对A549增殖的影响 ±s，n=6)

2.3联合用药对肺腺癌A549细胞增殖的影响:因此联合用药时地塞米松以1000ng/mL进行，奥沙利铂以5μg/mL浓度进行下一步考察。基于此，继续将研究分为空白组，溶剂组、地塞米松组(1000ng/mL)、奥沙利铂组(5μg/mL)以及地塞米松+奥沙利铂组，连续给药24h、48h、72h后发现干预24h后即对肺腺癌A549细胞增殖产生抑制作用，联合用药组OD值明显低于单用组，即联合用药其抑制率显著高于其他单用组，且趋势随着用药时间的延长而逐渐明显，见表3。

表3　联合用药不同时间对A549的增殖影响 ±s)

3讨论

我国每年肺癌新发病例约有21万例，且每年死于肺癌的国人约为60万[4，5]。晚期非小细胞肺癌在临床上占80%～85%[6，7]，其中肺腺癌是最常见的病理类型，占晚期非小细胞肺癌的将近70%。奥沙利铂(Oxaliplatin)为铂类抗肿瘤药物，通过与DNA的烷基化作用从而促进肿瘤细胞的凋亡，因其安全性优于顺铂、肿瘤亲和性优于卡铂，奥沙利铂现已替代顺铂及卡铂成为第三代铂类抗肿瘤药物，为治疗多种实体瘤的一线用药。大量临床研究证明，以铂类为基础的联合化疗可显著延长晚期非小细胞肺癌的生存期，改善其生活质量[8]，但由于其对人体的毒性，不良反应也较多，且剂量需要合理把握。地塞米松因具有明显抗炎抗过敏效果而被广泛认识，随着现代医学研究的不断深入，地塞米松促进肿瘤细胞凋亡的效能被逐渐挖掘，其通过阻滞肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞膜变性坏死、抗血管新生等途径发挥抗肿瘤作用，同时地塞米松可增强机体对抗肿瘤药物的敏感性，但是不同学者对于联合用药的剂量尚存在争议，基于此，本试验采用体外研究方法，探讨二者联合用药协同抗人肺腺癌的部分机制及用量。

本实验中，地塞米松、奥沙利铂分别以不同浓度及不同时间点作用与A549细胞后我们发现：单用地塞米松时当浓度低于500ng/mL时反而会促进肺腺癌A549细胞增殖，当浓度达到500ng/m后地塞米松对肿瘤细胞的抑制率呈浓度及时间依赖性。奥沙利铂对肺腺癌A549细胞的抑制效应具有明显的时间及浓度依赖性，当药物浓度处于5μg/mL及10μg/mL时对肿瘤细胞的抑制作用相当，因此我们认为地塞米松以剂量为1000ng/m，奥沙利铂5μg/mL抑制作用最佳，因此可推测地塞米松、奥沙利铂在体外均能明显抑制A549细胞的增殖；当二药联合给药以后发现联合用药组的抑瘤率显著高于二药单用，同时抑制率随着用药时间的延长而逐渐增大，因此我们认为地塞米松及奥沙利铂联合使用可以达到协同作用，同时这一结果又提示我们选择地塞米松促进机体对抗肿瘤药物敏感时需要注意其使用剂量。

联合治疗本着增效减毒的目的，通过药物与药物、药物与基因、药物与蛋白等方式，以不同或相似的作用机制，在治疗肺癌方面发挥着极大的作用。随着深入研究，找出对肺癌具有治疗或辅助治疗作用的药物联用组合，对降低肺癌的致死率及转移率，提高其治愈率、改善患者的生活质量具有非常重要的意义。地塞米松能协同奥沙利铂抑制人肺腺癌A549细胞的生长，达到一定剂量阈值时能显著增强对肿瘤的抑制作用，为临床治疗肺癌的提供了科学依据和参考。

参考文献:

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