淫羊藿苷促进软骨细胞体外3-D培养下生成软骨

王鹏珍万超1

(暨南大学生命科学与技术学院,广东广州510632)

摘要〔〕目的探究淫羊藿苷(ICA)对软骨细胞在体外3-D培养条件下的作用。方法将胎鼠原代软骨细胞分成对照组和ICA浓度梯度组，通过MTT法、阿尔新蓝染色、酶联免疫吸附法，确定出ICA最有效浓度为10-6 mol/L，并将此浓度用于后续软骨生成实验。软骨细胞接种于Gelfoam®上，形成复合块，分为对照组和ICA组，进行形态学和免疫组化以及 Real-time PCR分析。结果细胞培养14 d时，ICA能显著促进胶原蛋白和蛋白聚糖分泌。此外，利用Gelfoam®进行软骨细胞3-D培养，ICA促使软骨细胞中蛋白聚糖、胶原蛋白(collagen)Ⅱ，HIF-1α和Sox9在mRNA和蛋白水平表达均显著上调，且与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论淫羊藿苷可以促进软骨细胞在体外3-D培养条件下生成软骨。

关键词〔〕淫羊藿苷；软骨细胞；胶原蛋白；蛋白聚糖；羟脯氨酸

中图分类号〔〕Q813〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81171717)

通讯作者：万超(1972-)，男，教授，主要从事软骨疾病治疗与修复研究。

1香港中文大学再生医学教育部重点实验室

第一作者：王鹏珍(1988-)，男，硕士，主要从事软骨修复研究。

Icariin promote chondrocytes cultured on 3-D condition to generate new Cartilage in vitro

WANG Peng-Zhen, WAN Chao.

College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the mechanism of cartilage formation from chondrocytes treated by Icariin on 3-D condition in vitro.MethodsThe immature chondrocytes were divided into control and icariin concentration gradient groups. The most effective concentration of ICA was determined by MTT assay,Alcian blue staining and enzyme-linked immunosorbent assay, 10-6 mol/L ICA was determined as the most effective concentration and then used for subsequent experiments. Chondrocytes were seeded on Gelfoam® to form a complex block. The blocks were divided into control and ICA groups.ResultsICA significantly promoted the synthesis of collagen and proteoglycans of chondrocytes after being treated for 7 and 14 days. There were significant differences between ICA and control groups. Moreover, when the chondrocytes were cultured on Gelfoam®, ICA promoted chondrocyte special mark gene: aggrecan, collagen Ⅱ, HIF-1α and Sox9 to up-regulate in mRNA and protein levels. There were significant differences between ICA and control groups.ConclusionsIcariin could promote chondrocytes cultured on 3-D condition to generate new cartilage in vitro.

【Key words】Icariin;Chondrocyte;Collagen;Proteoglycan;Hydroxyproline

TGF-β具有抑制软骨细胞分化、维持软骨细胞表型的作用，为了抑制软骨细胞过早分化为肥大软骨细胞，从而影响骨骼纵向发育，TGF-β常被用于临床治疗〔1〕。但是，TGF-β的价格贵、易降解、易失效等特点常常限制其临床使用。淫羊藿苷(ICA)对神经系统、内分泌系统、心血管系统和免疫系统等都能发挥药理作用，尤其是ICA对软骨发育方面的作用〔2〕。有报道证实，ICA对体外培养的兔软骨细胞具有显著促增殖作用，而且可以显著促进软骨细胞胞外基质的合成〔3，4〕。而且，ICA具有促进家兔软骨下骨损伤修复的作用〔5〕。这种作用至少可归因于ICA可以促进软骨细胞特异基因的表达和软骨胞外基质的分泌的能力。并且，这种作用已在家兔和大鼠体内得到实验证实〔6，7〕。然而，其潜在的作用机制和信号通路还不清楚。本研究拟检测ICA对胞外基质合成的影响。

1材料与方法

1.1主要试剂ICA，批号:20090503，购于南京泽朗医药科技有限公司，HPLC 测定 ICA 含量不低于98%。DMEM培养基 (含10%小牛血清，100 U/ml青/链霉素和20 mmol/L L-谷氨酰胺)，DMEM诱导培养基 (含10%小牛血清，100 U/ml青/链霉素，20 mmol/L L-谷氨酰胺，0.05 mmol/L β-甘油磷酸钠和0.1 mmol/L抗坏血酸)。Ⅰ型胶原酶，D型胶原酶，噻唑蓝(MTT)，二甲亚砜(DMSO)。小鼠蛋白聚糖 (aggrecan)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(上海武昊，批号HZ-E14727)。小鼠羟脯氨酸 (hydroxyprolin) ELISA试剂盒 (武汉华美，批号CSB-E08839m)。抗兔 HRP/DAB(ABC)免疫试剂盒批号(abcam，ab 64261)。兔抗鼠Sox 9(sc-166505，Santa Cruz)，兔抗鼠HIF-1(NB100-105，NovusBio)。

1.2软骨细胞的分离和培养软骨组织取自新生2 d的小鼠，关节组织用0.7 mg/ml的胶原蛋白酶I 消化30 min，移入含0.7 mg/ml的胶原蛋白酶Ⅰ和3 mg/ml胶原蛋白酶D的PBS混合液中37℃消化6 h。用180 mm的滤膜过滤消化下来的软骨细胞，离心后用PBS洗3次，将细胞重悬在DMEM中，之后在5% CO2，37℃条件下培养，每3 d换液1次。

1.3MTT检测当第2代细胞长势达到培养板面积80%～90%时，加入0.25%胰酶消化，用细胞计数器和台盼蓝染液确定细胞成活率>95%。细胞离心重悬后，种在96孔培养板。培养基中含ICA浓度依次为10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L；对照组不含ICA。每孔设置3个复孔。每孔细胞数为2×104，软骨细胞在37℃、5% CO2培养箱培养。培养基每3 d 换液1次。分别在3、7和14 d后，每个孔加10 μl MTT，继续培养4 h，直到终止培养。之后，移除培养基，每孔加入150 μl DMSO，96孔板在酶标仪570 nm测定吸光度A值。

1.4阿尔新蓝染色将消化后的2代细胞重悬至密度为1×107个/ml，吸取10 μl接种到24孔板，小心滴在孔中间。3 h后，细胞贴壁，加入DMEM诱导培养基。隔天加入1 ml含ICA浓度依次为10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的DMEM诱导培养基，对照组加入不含ICA，其他条件完全相同的培养基。每3 d换液1次，分别经过7 d和14 d，弃掉培养基，用 PBS清洗1次，加入1 ml 10%甲醛固定20 min。之后用去离子水清洗3次，最后一次洗涤细胞微团15 min。每孔加入0.5 ml 1%阿尔新蓝染液，室温下染色1 h以上。弃掉染液，用70%乙醇洗涤2次，去离子水洗涤3次，晾干后，用扫描仪扫描图片，记录细胞染色区域与强度。用IPP6.0软件测定图片的平均光密度(IOD)，对染色强弱进行定量分析。

1.5ELISA测定aggrecan和hydroxyprolin浓度ICA处理7 d和14 d后，软骨细胞用PBS洗3次，每孔细胞加入含 PMSF的RIPA温和裂解液，冰上裂解30 min，收集到1.5 ml无菌离心管中。离心取上清液，按照小鼠蛋白聚糖酶联免疫分析 (ELISA) 和小鼠羟脯氨酸ELISA试剂盒提供的步骤，450 nm波长处依序测量各孔的OD值，根据标准曲线，计算aggrecan的浓度，每孔的胶原蛋白的浓度用hydroxyprolin的量来表示。

1.6软骨细胞和Gelfoam®复合块构建无菌的Gelfoam®在超净工作台内紫外照射2 h。将 30 μl密度为 3×106个/ml细胞悬液沿各个面注入9 cm3的 Gelfoam®材料中。3 h后，细胞贴壁后形成复合块。由前面MTT实验、阿尔新蓝染色结果和酶联免疫分析可知，ICA为10-6mol/L时，最有利于软骨细胞分泌胞外基质，因此用含 ICA 浓度为10-6mol/L的DMEM诱导培养基对Gelfoam®复合块构建进行培养。正常诱导培养基培养作为对照组，每 2 d 换液1次。14 d后，收获复合块，分别用于后续的组织形态学，免疫组化分析和Real-time PCR分析。

1.7组织形态学和免疫组化分析Gelfoam®复合块收获后，用4%多聚甲醛固定，梯度蔗糖脱水，OCT包埋，液氮快速凝固，做成厚度为10 μm的冰冻切片，用于形态组织学分析，包括H&E染色、番红O-固绿染色。免疫组化按HRP/DAB(ABC)免疫试剂盒说明操作。一抗:抗鼠 Sox9 (sc-166505，Santa Cruz)，稀释比为1∶100，4℃过夜。抗鼠HIF-1(NB100-105，NovusBio)，稀释比为1∶50，4℃过夜。IgG作为阴性对照。软骨生成率表示为:红色面积/总面积(%)。免疫组化半定量结果由本课题组不参与该实验的其他成员来鉴定。具体方法:在显微镜下，随机选择组织切片的3个视野进行对阳性细胞和总细胞计数，即阳性表达率=阳性细胞/总细胞(%)。

1.8逆转录和Real-time PCR收集Gelfoam®复合块，并用PBS清洗2遍，之后加入 Trizol提取mRNA。根据逆转录试剂盒(9068-38-6，promega)说明书，用 oligo-dT12-18 作为引物，用 MMLV反转录酶，将1 μg总RNA进行 cDNA第一链合成。Real-time PCR 用 CFX96TMReal-Time PCR检测系统(Bio-Rad)检测，使用SYBR Premix ExTaq (RR420A，Takara) 试剂盒，按照说明书要求进行操作。以2-△△t值作为基因mRNA扩增倍数来定量分析。以β-actin 作为内参。目的基因引物序列参见表1。

表1　目的基因引物序列

1.9统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行单尾ANOVA检验。

2结果

2.1MTTICA浓度为10-5mol/L时，ICA对软骨细胞并没有表现出促进增殖作用。ICA浓度为10-5mol/L时，3个时间段包括1 d(P<0.01)，2 d(P<0.01) 和3 d(P<0.01)，ICA都对软骨细胞表现出明显的增殖作用；与对照组相比，具有统计学差异。而ICA浓度为10-7mol/L对软骨细胞表现出一定的促进增殖作用；但与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。见图1。

与对照组比较：1)P<0.01 图1　不同浓度的ICA分别刺激软骨细胞1、2和 3 d后吸光度值的大小

2.2阿尔新蓝染色细胞培养7 d后，10-7mol/L (P<0.05)、10-6mol/L(P<0.01)和10-5mol/L(P<0.05)都明显地促进软骨细胞分泌aggrecan。细胞培养14 d后，10-7mol/L(P<0.05) ICA组、10-6mol/L(P<0.001) ICA组和10-5mol/L ICA(P<0.001)组，与对照组相比，aggrecan分泌量差异性均具有统计学意义。见图2，表2。因此，ICA可以促进软骨细胞分泌更多的aggrecan。考虑到ICA对软骨细胞的最佳作用效果和成本，选用10-6mol/LICA用于后续软骨细胞3-D培养实验。

图2　阿尔新蓝染色

时间点对照组10-7mol/L10-6mol/L10-5mol/L7d0.16±0.010.42±0.191)0.57±0.012)0.47±0.011)14d0.19±0.010.53±0.321)1.10±0.233)0.64±0.063)

与对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01，3)P<0.001；下表同

2.3ELISA检测结果ICA浓度为10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L都不同程度促进了aggrecan的表达。当10-6mol/L ICA处理细胞7 d后，aggrecan(P<0.01)的分泌量比对照组增加了1.1倍；而14 d后，aggrecan(P<0.001)的分泌量比对照组增加了2.1倍，与对照组相比，其表达量差异均具有统计学意义。hydroxyproline的表达量在一定程度上可以代表总胶原蛋白的表达量，所以可以用羟脯氨酸试剂盒检测hydroxyproline的表达量〔8〕。hydroxyproline经过7 d(P<0.05) 和14 d(P<0.001)的处理后，在10-6mol/L ICA实验组，hydroxyproline合成量明显多于对照组，且其表达差异性具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3　不同浓度ICA对软骨细胞分泌aggrecan和

2.4形态学分析和免疫组化与对照组相比较，ICA组的HE染色结果显示，大部分细胞形成细胞簇，软骨细胞分泌出更多的软骨基质，将细胞连接为更致密的组织。番红O-固绿染色主要用于检测新的软骨的形成，从图3B和图3D可以看出ICA组的新的软骨的面积大于对照组，ICA组与对照组新形成软骨的面积相对定量差异具有统计学意义(P<0.01)。免疫组化结果显示，Sox9和HIF-1α 均表达于细胞核，而且相比对照组，ICA组Sox9和HIF-1α阳性细胞数目显著性多于对照组。ICA 组的Sox9(P<0.01)和HIF-1α(P<0.01)表达率与对照组比具有统计学差异。这表明ICA可以促进Sox9和HIF-1α在核内的表达。见表4。

(A)对照组HE染色；(B)对照组番红O-固绿染色；(C)ICA组HE染色；(D)ICA组番红O-固绿染色；标尺：50 μm 图3　Gelfoam ®复合块HE、番红O-固绿染色

(A)Sox9在对照组中的表达；(B)HIF-1α在对照组中的表达；(C)Sox9在ICA组的表达；(D)HIF-1α在ICA组表达；标尺：50 μm 图4　Gelfoam ®复合块免疫组化染色和Sox9和 HIF-1α阳性细胞数统计

2.5ICA对软骨细胞特异基因表达的影响ICA刺激软骨细胞 7 d时，collagen Ⅱ、Sox9和aggrecan表达量都有不同程度的上调，aggrecan mRNA(P<0.01)、collagen Ⅱ mRNA(P<0.01)、Sox9 mRNA (P<0.01)和HIF-1α mRNA (P<0.01)表达量显著高于对照组。ICA刺激软骨细胞14 d后，aggrecan mRNA(P<0.001)、collagen Ⅱ mRNA(P<0.001)、Sox9 mRNA(P<0.001) 和HIF-1α mRNA(P<0.01)的表达量显著增加，与对照组相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见图4，表5。

表4　各组软骨生成率、Sox9和

表5　ICA处理软骨细胞7 d 和14 d后,

3讨论

本研究证实 ICA浓度为10-6mol/L时，对软骨细胞起到显著的增殖作用。通过阿尔新蓝染色和酶联免疫吸附检测，发现aggrecan和hydroxyproline在 ICA浓度为10-6mol/L时，表达量最大。软骨细胞胞外基质包括 collagen Ⅱ和aggrecan。Aggrecan形成的致密的网状结构不仅能维持关节软骨的结构完整性，而且还能发挥软骨细胞的正常的生物学功能，如迁移能力、细胞黏附能力及细胞增殖和分化〔9，10〕。软骨胞外基质甚至可以调控细胞分化与增殖，维持损伤组织的代谢与再生〔11〕。

本研究将细胞种在无菌的Gelfoam®材料上，模拟体内软骨微环境。在此基础上，进行免疫组化和形态组织学分析以及real-time PCR分析。结果显示，在ICA作用下，软骨细胞有助于向软骨组织演进，以及aggrecan、collagen Ⅱ、HIF-1α 和Sox9 在蛋白水平和mRNA水平上表达上调。HIF-1α，对于哺乳动物，是一个低氧反应调节因子，介导低氧条件下软骨特异基因的表达。HIF-1α蛋白的核内聚集会促使Sox9启动子活性的增加，进而促进collagen Ⅱ和aggrecan mRNA的表达增加〔12〕。文献报道，Sox9是早期软骨发育的一个必不可少的转录因子，在Sox5和Sox6的辅助下，Sox9直接激活软骨胞外特异基质基因〔13〕，包括 Sox9介导的collagen Ⅱ靶基因的表达。最新文献中，免疫沉淀实验证明HIF-1α和Sox9之间相互作用，而且 HIF-1α指导Sox9的活性〔14〕。本实验也证实了HIF-1α和Sox 9之间的正相关关系，究其机制，可能是Gelfoam®这种材料，使细胞聚集成团，形成内部相对缺氧的三维立体环境。在这种条件下，ICA刺激低氧诱导因子HIFs 结合到乏氧反应元件(HRE)，激活其转录，从而诱发Sox9及其下游基因 aggrecan 和collagen Ⅱ的表达。而且Gelfoam®材料本身致密性的立体结构，有利于高密度的细胞黏附、增殖，以及细胞之间的信号传递，也可使细胞分泌的细胞外基质固守在细胞的附近，充分发挥细胞外基质对细胞增殖、分化及代谢的调节作用，为维系细胞的生长和代谢提供适宜的微环境。但Gelfoam®材料对软骨细胞的作用如何，需要下一步将Gelfoam®材料作为单一影响因子进行研究。

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〔2015-04-30修回〕

(编辑曲莉)

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