车爽+程然+蒋薇+张健+薄士儒

摘要：目的：研究鹿茸胶原蛋白对创伤愈合的影响，比较不同浓度胶原蛋白对创伤愈合的影响程度。方法：采用低温酶解法提取鹿茸胶原蛋白，在正常小鼠皮部造成急性创伤模型，设1个对照组，1个京万红阳性对照组，3个实验组分别涂不同浓度胶原蛋白。观察创面愈合情况，用创伤愈合率体现。并测其皮肤强脯氨酸含量，进而对比胶原含量。结果：高浓度胶原蛋白涂抹的伤口愈合率较高，其皮部胶原较多。结论：鹿茸胶原蛋白对创伤愈合有促进作用，且愈合程度与胶原蛋白的浓度有关。

关键词：生药学； 胶原蛋白；创伤愈合；羟脯氨酸

中图分类号： S865.42 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.13.017

鹿茸具有广泛的药理作用，但是深加工研究滞后，对其提取物有效活性成分的研究甚少。胶原蛋白由于结构独特，理化性质及生物特性非常突出，在医疗上的应用具体表现在胶原蛋白具有低免疫源性、组织之间的协调作用强、物理机械性能好，可生物降解度高，具体体现在止血、治疗烧伤和骨折等方面手术的应用。

目前，以鹿茸为主料，分离提取出对医学，对机体具有调节作用的胶原蛋白活性物质成分，研究其对皮肤创伤愈合作用的研究未见报道。通过本研究为后续开发鹿茸胶原蛋白相应的药品（如喷剂）奠定理论基础，以达到科学利用现有的鹿茸资源，增加鹿茸产品附加值的目的，从而促进我国鹿业养殖实现可持续性发展。

1 材料与方法

1.1主要仪器设备

紫外可见分光光度计、高速离心机、真空冷冻干燥机。

1. 2实验材料

新鲜鹿茸，清洁级胰蛋白酶，清洁级小白鼠50只，羟脯氨酸标准品等。

1.3方法

1.3.1提取 在4℃条件下，利用盐酸使梅花鹿茸灰分中的不溶物变成可溶性盐类，选择氯化钠溶液作为除杂蛋白的主要试剂，达到将其脱除的目的[1]。采用徐云凤的胰蛋白酶水解制备鹿茸胶原蛋白的方法，取新鲜的鹿茸50克，加入150毫升乳酸盐的缓冲液，用组织绞碎机绞碎，加入胰蛋白酶0.5克，加入激活劑氯化锰0.05克，pH值调为8.0，将溶液的温度调至52℃，放入反应罐3小时，离心去残渣，收集透明澄清的液体，在10℃条件下进行酶解提取[2]。

1.3.2纯化 在中性条件下盐析全部胶原蛋白，方法如下：向梅花鹿茸胶原蛋白酶解液中缓慢加入，并搅拌经过研磨的氯化钠，充分搅拌，静止10～24小时，以便胶原蛋白充分析出，再以8000转的速度离心，收集沉淀物后用0.5mol/L乙酸进行溶解，并对0.5mol/L乙酸进行透析，以便除去沉淀中的多余盐分，最后将样品进行真空冻干[3]。

1.3.3动物造模分组及给药 购买清洁级小白鼠50只，分别用乙醚进行浅麻醉。局部备皮，常规消毒，将小鼠皮部取直径为1厘米的圆形切口，切开皮肤全层， 至深筋膜， 制作出直径相同的圆形创面， 然后以无菌纱布覆盖， 造模完成。把小鼠随机分成五组，根据人和小鼠的体重与表面积比计算得出小鼠给药量=小鼠体表面积×小鼠体重/人的体表面积×人的体重×人体用量。设高、中、低3个实验组，1个空白对照组，1个阳性对照组，将实验组创面分别使用0.05mol/L，0.25mol/L，

0.5mol/L的梅花鹿茸胶原蛋白，每日两次，空白组不进行药物治疗，阳性对照组用京万红以相同药量做阳性对照。以无菌纱布覆盖，防止感染，连续给药观察。

1.3.4羟脯氨酸含量检测 胶原蛋白是构成结缔组织中胶原纤维的主要成分，含羟脯氨酸的量最多，是愈合组织中最重要的成分，在一定时间内，创伤愈合部位组织中的胶原蛋白的含量会反映伤口的愈合程度[4]。羟脯氨酸是胶原蛋白中的特征性氨基酸，因此测定动物组织中羟脯氨酸的含量即可定量观察创伤组织的愈合程度。取创面皮肤经脱水及脱脂处理后水解，根据羟脯氨酸的测定原理，使用氯化亚锡对梅花鹿茸胶原蛋白样品进行水解使其释放羟脯氨酸，加入氯氨T、二甲氨基苯甲醛，于558纳米波长处比色，比较羟脯氨酸含量。若实验组羟脯氨酸含量高于空白对照组，则说明创面胶原蛋白水平提高，即创面伤口愈合情况较好[5]。

1.3.5创面愈合情况评价 描记创面愈合面积，以创面完全上皮化（病理证实）作为判断依据，记录创面愈合时间。每天观察伤口愈合情况，并将创面描记在半透明的纸上，再以半透明纸作为模板，将质地均匀的硬纸片剪成图样大小，以硬纸片重量间接表示创面及愈合部分面积大小，将数据统计起来，并以下式计算：创面愈合率（%）=（开始创伤面积-未愈合创面面积）/开始创伤面积[6]。再以实验组和对照组的创面愈合率进行对比，来确定鹿茸胶原蛋白是否起到愈合伤口的作用[7]。

2 实验结果

2.1 组织学观察

5个分组创伤涂药后均有不同程度的创面肿胀、渗出现象。伤口用药组涂药后创面出现肿胀、渗出程度较对照组轻。5个分组创伤2天后创面均有不同程度的干燥、结痂现象，其痂皮呈淡黄色，质地较软，无异常分泌物出现及感染情况出现。

2.2 小鼠创面愈合率（见表1）

2.3羟脯氨酸标准样品浓度与吸光度的测定结果（见表2）

2.4以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线（见图1）

计算其回归方程为：y=0.076x+0.0035，r=0.9995（P<0.001），因此，吸光度和羟脯氨酸浓度之间有很好的相关性。

2.5小鼠组织中羟脯氨酸含量的测定（见表3）

由表3可知，小鼠创伤处组织中羟脯氨酸的含量逐渐递增，由于羟脯氨酸浓度和胶原蛋白浓度成正相关，羟脯氨酸浓度的变化即可反映小鼠组织中胶原蛋白的变化，由此可知，鹿茸胶原蛋白对伤口愈合的对比情况。

3 讨论与分析

经实验初步证明，鹿茸胶原蛋白对伤口创伤愈合有促进作用，不同浓度胶原蛋白对伤口的愈合率不同，高浓度的愈合率大于不用药的伤口愈合率，且伤口的愈合程度与鹿茸胶原蛋白的浓度有关。

参考文献

[1]叶易春，但卫华.酶法提取牛键胶原的研究[J].中国皮革，2005，34（07）：4-7.

[2]周文常，但卫华，廖隆理，等.猪皮胶原蛋白的提取及其结构表征[J].中国皮革， 2004， 33（13）： 36-38.

[3]王燕，付万冬，郑斌.酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白[J].食品科技，2011，（06）.

[4]付小兵，孙同柱.几种用于创作修复研究的动物模型.中华实验外科杂志，1999，16（05）： 479-480.

[5]陈玉华，廖仕成，李瑞园，等.乳及乳制品中羟脯氨酸测定方法的研究[J].职业与健康，2010，2（03）：283-285.

[6]彭方毅，周欢，姜海蓉，袁兵占，崔玉花.一种新型优化的肺组织羟脯氨酸水平测定方法的建立[J].重庆医学，2014，（11）.

[7]杨晶，孙凤，丁武.波尔山羊杂交代肌肉中羟脯氨酸含量的测定及其与肌肉品质的关系[J].农产品加工（学刊），2012，（01）.

作者简介：车爽，在读本科生，研究方向，制药工程。

通讯作者：薄士儒，硕士，助教， 研究方向：生药学和药理学。