小鼠脑缺血/再灌注损伤皮质区超氧化物歧化酶、丙二醛、活性氧表达与细胞凋亡的关系及姜黄素的干预作用

李焰刘凤丽1程冉冉1王芳1周燕1

(河北工程大学附属医院，河北邯郸056002)

摘要〔〕目的探讨姜黄素对小鼠皮质区缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响及与超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)表达的关系。方法采用线栓法阻塞小鼠大脑中动脉(MCAO)，建立小鼠局灶性脑缺血/再灌注实验模型，90只昆明小鼠被随机分为假手术组(S组)、缺血/再灌注组(I组)和姜黄素(缺血前30 min腹腔给予10、20、40 mg/kg)组(C1、C2和C3组)，每组18只。各组于缺血2 h分为再灌24、48、72 h等三个亚组。在预定时间点观察小鼠神经功能缺失的评分；TTC 染色测定脑梗死体积；TUNEL法检测细胞凋亡变化。测定各组小鼠血浆中SOD活性，MDA、ROS含量。结果24 h神经功能评分及脑梗死体积I组明显高于S组，C1、C2、C3组神经学评分及脑梗死体积低于I组(P<0.05)。SOD活力I组与S组相比较明显下降。C1、C2、C3组与I组相比SOD活力升高(P<0.05)。ROS、MDA含量I组与S组相比较明显上升，C1、C2、C3组与I组相比ROS、MDA含量明显下降(P<0.05)。结论姜黄素对脑缺血再灌注氧自由基损伤具有保护作用，其抗氧化作用机制可能与调节相关凋亡基因表达减轻细胞凋亡有关。

关键词〔〕姜黄素；脑缺血再灌注；氧自由基损伤；凋亡

中图分类号〔〕R285〔文献标识码〕A〔

基金项目：邯郸市科技局课题(No.1123108080-17；1223108086-15)

1河北工程大学

第一作者：李焰(1973-)，男，主治医师，主要从事脑血管疾病治疗和机制研究。

脑缺血再灌损伤与氧自由基的大量产生有密切关系。脑缺血再灌后氧自由基迅速增加，脑组织和血清中脂质过氧化水平升高，氧自由基清除剂在脑缺血再灌时具有脑保护作用。姜黄素来源于姜科姜黄属植物姜黄的干燥根茎，具有抗氧化、抗炎、抗感染、抗肿瘤的作用，近来研究也表明，姜黄素在抗细胞凋亡中也起着不容小觑的作用〔1〕。也有学者指出姜黄素对心肌〔2〕、脑〔3〕、肠〔4〕等脏器的缺血再灌注损伤有保护作用，但姜黄素对于小鼠脑缺血再灌损伤的保护作用，具体机制不详。本文通过观察姜黄素对小鼠自由基损伤指标的前后表达变化，结合皮质区细胞凋亡的检测，进一步探讨姜黄素抗缺血/再灌注损伤的保护作用机制。

1材料与方法

1.1动物及分组90只健康雄性昆明小鼠，清洁级，体重28～32 g，由河北工程大学医学院实验动物中心提供。术前在22℃～25℃实验室中饲养1～2 d以适应实验室环境。动物随机分为：假手术组(S组)、缺血再灌注组(I组)、姜黄素低、中、高剂量组(C1、C2、C3组)，治疗组于脑缺血前1 h腹腔给予10、20、40 mg/kg姜黄素。每组缺血2 h再灌后分为24、48、72 h等三个亚组，每组小鼠6只，分别用于神经功能学评分、TTC检测及自由基指标和原位缺口末端标记法(TUNEL)检测。

1.2主要试剂姜黄素购自美国Sigma公司，用二甲基亚砜溶解配置10 mg/ml储存液，避光于4℃冰箱保存；活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。TUNEL试剂盒购自Santa Cruz生物公司。

1.3动物模型的制备根据Longa等〔5〕法及国内现有报道制作本模型，显微手术断开颈外动脉后插入远端涂有硅胶约为0.1 mm的日本进口鱼线，深度为距颈总动脉分叉处(1±0.1)cm，缝合皮肤，造成小鼠MCAO模型。90 min后，拉鱼线至颈外动脉残端，假手术组除插线0.1 cm外，其余步骤同模型组。

1.4脑梗死灶的测定再灌注24 h后，小鼠断头取脑，续冠状切成2 mm厚的脑片，于2% TTC 中染色30 min，4%多聚甲醛固定2 h以上。计算机图像处理系统测量每一脑切片尾侧面的梗死面积，将各脑切片的梗死面积乘以2 mm (脑片厚度)再相加，既为梗死灶体积。

1.5神经功能检测评分动物麻醉清醒后，参照Longa等〔5〕5分法进行神经功能评价。0分：无神经损伤体征；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾斜；4分：不能自发行走意识丧失。

1.6TUNEL检测细胞凋亡切片常规脱蜡至水，滴加蛋白酶K，湿盒中37℃孵育30 min，滴加 TUNEL混合溶液，50 μl/片，湿盒中37℃孵育60 min，滴加转化剂 AP，50 μl/片，湿盒中37℃孵育30 min，DAB显色，脱水，透明，封片。以不含末端脱氧核苷酸转移酶的液体代替TUNEL 混合液作阴性对照。阳性率的定量分析：每个标本取4张切片，每张切片在海马随机选取4个视野，在200倍光镜下应用目镜网格测试系统，计数阳性细胞。

1.7生化指标测定再灌注后各相应时间点，处死小鼠，迅速取脑称重。用生理盐水制成10%脑组织匀浆液，低温离心，取上清液，按试剂盒说明书分别测定大脑组织中SOD、ROS、MDA含量。按考马斯亮蓝法标定蛋白含量。

2结果

2.1神经功能行为评分缺血后各组动物均出现神经功能损害症状，神经功能缺损评分均高于S组(P<0.05)。与I组比较，C组神经功能缺损评分有所下降(P<0.05)，见表1。

2.2TTC染色结果缺血后缺血侧鼠脑肿胀，有明显的梗死灶形成，TTC染色正常脑组织呈红色，缺血灶呈苍白色。应用姜黄素后可见明显缩小的梗死灶(P<0.05)，见表1。

表1　各组大鼠再灌注24 h后梗死体积比例及神经功能

与S组比较：1)P<0.05；与I组比较：2)P<0.05；下表同

2.3脑组织匀浆MDA含量Ⅰ组与C组含量与S组比较均明显升高(P<0.05)；C组和Ⅰ组比较，C组相同时点MDA含量明显下降(P<0.05)，见表2。

2.4脑组织匀浆ROS含量I组与C组含量与S组比较均明显升高(P<0.05)；C组和I组比较，C组相同时点ROS含量明显下降(P<0.05)，见表3。

2.5脑组织匀浆SOD含量I组与C组含量与S组比较均明显降低(P<0.05)；C组和I组比较，C组相同时点SOD含量明显升高(P<0.05)，见表4。

表2　各时间点脑组织匀浆MDA含量

表3　各时间点脑组织匀浆ROS含量比较

表4　各时间点脑组织匀浆SOD含量比较

2.6细胞凋亡检测结果I组与S组比较，伤后24 h TUNEL阳性细胞开始显著增加(P<0.05)，随着时间推移阳性细胞表达逐渐增多，伤后48 h达高峰(P<0.05)。C组TUNEL阳性细胞各时相表达与模型组相似，但TUNEL阳性细胞数明显减少，各时相点差异有统计学意义(P<0.05)。见表5，图1。

表5　各组脑组织凋亡细胞比较

图1　各组再灌注48 h脑组织凋亡细胞(TUNEL，×200)

3讨论

缺血性脑血管疾病具有发病率高、死亡率高、致残率高及复发率高的特点，严重危害了人类的健康和生命。由于大脑中动脉是临床缺血性脑血管病的易患部位，因而大脑中动脉阻塞模型(MCAO)是目前常用的脑缺血动物模型。本研究复制的小鼠MCAO模型具有典型的神经功能缺损表现，TTC染色可见明显的梗死灶，说明本实验采用的动物模型符合实验要求。同时预先给予姜黄素后，小鼠的神经功能学评分明显改善，脑梗死体积明显缩小，说明其对脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用，与既往研究一致〔3〕。

本研究结果表明，脑缺血再灌注时体内氧化系统被激活，抗氧化系统受抑制，氧自由基大量生成而清除减少，体内氧自由基水平急剧升高，从而引发一定程度的脂质过氧化反应。姜黄素是中药姜黄的主要成分，其副作用小，有重要的经济价值和广泛的药理作用，现代医学研究显示〔3，6，7〕，姜黄素具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗HIV-1整合酶等作用。而本实验结果说明姜黄素可减少和抑制实验小鼠脑内自由基的生成，具有抗氧化作用〔2〕。

脑缺血再灌注后存在神经细胞凋亡，如何减少或抑制缺血再灌后神经细胞凋亡、改善神经功能障碍一直是神经科学的研究热点。在本实验中，发现姜黄素各组可以显著减少各时间点神经元凋亡，说明其对凋亡通路起了负调控作用。同时研究发现，细胞凋亡的高峰出现在48 h，与SOD活性的高峰，MDA、ROS含量高峰期相比较，出现的较晚，推测其可能通过调控某些信号通路而抑制了细胞凋亡〔8〕。胞内信号转导通路十分复杂，因此还需对姜黄素抗缺血缺氧性神经元凋亡作更为深入的研究。以进一步明确姜黄素在脑缺血再灌注损伤中的作用。

4参考文献

1张文华，周璐，徐淑军.Caspase-3激活和细胞色素c释放在脑缺血再灌注损伤中的作用〔J〕.山东大学学报(医学版)，2007；45(12)：1193-6.

2伍陈海.姜黄素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.重庆医学，2011；40(1)：25-9.

3Lei J R，Qin J，Zhang J，etal.Effects of curcumin on inflammatory reaction and blood-brain barrier permeability in rats following cerebral ischemic injury〔J〕.Chin Pharmacol Bull，2010；26(1)：120-3.

4褚薇薇，聂蕾，和新盈，等.细胞色素c在后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤细胞凋亡中的变化〔J〕.生理学报，2010；62(2)：143-8.

5Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats 〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

6Thiyagarajan M，Sharma SS.Neuroprotective effect of curcumin in middle cerebral artery occlusion induced focal cerebral ischemia in rats〔J〕.Life Sci，2004；74(8)：969-85.

7Hsuuw YD，Chang CK，Chan WH，etal.Curcumin prevents methylglyoxal induced oxidative stress and apoptosis in mouse embryonia stem cells and blastocysts〔J〕.J Cell Physiol，2005，205(3)：379-86.

8纪风涛，曹铭辉，梁建军.姜黄素预处理对大鼠脑缺血/再灌注损伤后AQP-4及脑水肿的影响〔J〕.中国药理学通报，2011；27(4)：524-7.

〔2013-06-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)