十全大补汤含药血清对A549和A549/DDP细胞株顺铂耐药性及凋亡的影响

高原陈奇1于宁2张洪源2敬一夫2关蕊2田子鹤2张城城2李春晖2

(辽宁中医药大学病理教研室，辽宁沈阳110847)

摘要〔〕目的研究十全大补汤含药血清对人肺腺癌顺铂(DDP)敏感细胞株A549和耐药细胞株A549/DDP耐药性及凋亡的影响。方法将24只SD大鼠随机分为十全大补汤含药血清低剂量组(1.625 g/ml)、中剂量组(3.25 g/ml)、高剂量组(6.5 g/ml)、空白血清组(等体积生理盐水)，每天灌胃给药1次，连续7 d后提取血清；MTT法检测各组细胞对DDP的半数抑制浓度(IC50)值，并计算耐药指数；Annexin Ⅴ/PI法检测各组细胞的早期凋亡率。结果A549细胞中，中、高剂量组IC50值均较空白血清组下降(均P<0.01)，而中剂量组的IC50值与高剂量组无差别，但较低剂量组显著降低(P<0.05)；A549/DDP细胞中，低、中、高剂量组的IC50值均较空白血清组下降(均P<0.01)，而中剂量组IC50值与高剂量组无差别，但较低剂量组显著降低(P<0.01)；DDP处理A549细胞后，中、高剂量组分别增加细胞的早期凋亡率(P<0.05，P<0.01)，中、高剂量组之间无差别(P>0.05)，但中剂量组较低剂量组增加细胞的早期凋亡率(P<0.05)；DDP处理A549/DDP细胞后，低、中、高剂量组均增加细胞的早期凋亡率(P<0.05，P<0.01)，但中、高剂量组之间无差别，而中剂量组较低剂量组增加细胞的早期凋亡率(P<0.05)。结论十全大补汤含药血清对A549及A549/DDP细胞均有降低DDP耐药性的协同增效作用，可能与其促进肿瘤细胞凋亡有关；在A549/DDP细胞中十全大补汤含药血清的协同增效作用更强，且中剂量含药血清效率最高、效果最佳。

关键词〔〕肺腺癌；十全大补汤；化疗耐药；细胞凋亡

中图分类号〔〕R273〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(81403303)；辽宁省教育厅科学研究项目(L2012333)；中国博士后科学基金(2014M551122)

1辽宁省体育科学研究所生理研究室

2辽宁中医药大学第一临床学院

第一作者：高原(1980-)，女，博士，副教授，主要从事中药调节肿瘤耐药作用及其机制的研究。

Effect of serum containing Shiquan Dabu decoction on cisplatin-resistance and apoptosis of A549 and A549/DDP cells

GAO Yuan, CHEN Qi, YU Ning,etal.

Department of Pathology, Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang 110847, Liaoning, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the effect of serum containing Shiquan Dabu decoction on cisplatin(DDP)-resistance and apoptosis of lung adenocarcinoma line A549, and its DDP-resistant subline A549/DDP.Methods24 SD rats were divided into low dose (1.625 g/ml)，moderate dose (3.25 g/ml) and high dose (6.5 g/ml) groups of Shiquan Dabu decoction and blank serum group (isometric normal saline). MTT assay was used to determine IC50 values of DDP. Annexin Ⅴ/PI staining method was used to detect early apoptosis.ResultsIn A549 cells, IC50 in moderate and high dose groups were lower than those of blank serum group (all P<0.01), there was no difference between moderate and high dose groups(P>0.05); however, IC50 in moderate group was lower than those of low dose group(P<0.05). In A549/DDP cells, IC50 in low, moderate and high dose groups were lower than that of blank serum group (all P<0.01), there was no difference between moderate and high dose groups(P>0.05), however, IC50 in moderate group was lower than that of low dose group (P<0.01). In A549 cells, the early apoptosis rate in moderate and high dose groups were higher than those of blank serum group(P<0.05，P<0.01), there was no difference between in moderate and high dose groups (P>0.05), however, the early apoptosis rate in middle group was higher than that of low dose group (P<0.05). In A549/DDP cells, the early apoptosis rate in low, moderate and high dose groups were higher than those of blank serum group (P<0.05，P<0.01), there was no difference between in moderate and high dose groups (P>0.05), however, the early apoptosis rate in moderate group was higher than that of low dose group (P<0.01).ConclusionsThe serum containing Shiquan Dabu decoction moderately have the synergistic effect of cisplatin-resistance on A549 and A549/DDP cells through promoting the apoptosis, and moderate dose has the best advantage.

【Key words】Lung adenocarcinoma; Shiquan Dabu decoction; Chemotheraphy resistance; Apoptosis

十全大补汤是益气补血、扶正固本的经典方，由四君子汤、四物汤加黄芪、肉桂组成。已有研究发现，十全大补汤可以抑制肿瘤生长、抑制肿瘤侵袭和转移、增强机体免疫系统功能、降低化疗药物对机体的损伤等〔1～3〕。本实验拟观察十全大补汤含药血清对A549和A549/顺铂(DDP)细胞株耐药性及凋亡的影响。

1材料与方法

1.1细胞株及动物A549细胞株由中国医科大学病理教研室提供，A549/DDP细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所。SD大鼠由辽宁中医药大学实验动物中心提供，雌雄各半，体重190～230 g，许可证号：SCXK(辽)2013-0010。

1.2中药及制备十全大补汤根据《方剂学》(中国中医药出版社，邓中甲主编)中规定用药及临床常用剂量(人参6 g，肉桂3 g，川芎6 g，熟地黄12 g，茯苓9 g，白术9 g，甘草3 g，黄芪12 g，当归9 g，白芍9 g)，全部药材购于辽宁中医药大学附属医院，并通过辽宁中医药大学药理实验室的鉴定，加水浸泡30 min后，按汤剂常规方法煎熬，过滤并浓缩成生药量含量为10 g/ml的药液，冷却后装入灭菌药瓶，4℃保存。

1.3试剂DMEM高糖培养基、RPMI1640培养基和胎牛血清均购自美国HyClone公司；胰蛋白酶、DMSO购自韩国BIOSHARP公司；DDP购自德国Calbiochem公司(Lot#D00117683)；MTT检测试剂盒购自上海碧云天公司；Annexin V/PI检测试剂盒购自北京四正柏公司。

猫作为我们最常见的猫科动物，已经被人类驯化了三千多年。在表示亲密时，它常会蹭人类的脸颊。这是因为猫的脸颊、耳朵、下巴跟腹侧，都分布着费洛蒙气味腺，其中脸颊部位分泌出来的费洛蒙，是它感到安心舒适时才会释放的。它会将这种气味蹭在喜欢的地方作为标记。

1.4含药血清的制备清洁级SD大鼠24只按随机数字表法分为十全大补汤含药血清低剂量组(1.625 g/ml)、中剂量组(3.25 g/ml)、高剂量组(6.5 g/ml)、空白血清组(等体积生理盐水)。每组每天灌胃给药1次，每次1 ml，连续给药7 d，末次给药1 h后，腹主动脉采血置于无菌管中，37℃水浴30 min，3 000 r/min离心10 min后取上清，再重复离心2次，56℃水浴灭活30 min，0.22 μm滤器滤过除菌，-20℃冻存备用。

1.5细胞培养在37℃、5%CO2的孵育条件下，A549细胞和A549/DDP细胞分别在含有10%胎牛血清(或10%含药血清)的DMEM和RPMI1640培养基中培养。当细胞融合度达到90%时，用0.25%的胰酶消化传代。

1.6MTT法检测十全大补汤含药血清对DDP半数抑制浓度(IC50)的影响取对数生长期的A549和A549/DDP细胞制成单细胞悬液5×103/ml，接种于96孔板中，每孔100 μl，待细胞贴壁后分组：10%含药血清低、中、高剂量组、10%空白血清组，加入含不同血清的培养基100 μl，每组设立6个平行对照，并设空白对照(不加细胞只加培养液，用于比色调零)，置正常培养条件下培养。24 h后用2、4、8、16、32、64、128 μmol/L DDP处理细胞，37℃、5%CO2继续培养48 h，实验终止前，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，弃去培养基，加入150 μl DMSO，振荡10 min后，置于酶标自动分析仪，在570 nm波长测定光吸收值(OD值)。计算IC50值，并按以下公式计算耐药指数：耐药指数=A549/DDP细胞IC50值/A549细胞IC50值。

1.7Annexin Ⅴ/PI法检测十全大补汤含药血清对细胞凋亡率的影响取对数生长期的A549和A549/DDP细胞制成单细胞悬液106/ml，接种于6孔板中，每孔1 000 μl，待细胞贴壁后分组(同MTT法)，37℃、5%CO2培养24 h后用20 μmol/L DDP处理细胞〔4〕，继续培养24 h，胰酶消化收集于1.5 ml离心管内。用预冷4℃无菌的PBS充分洗涤细胞2次，取总数1×106/ml的细胞待检测。用250 μl结合缓冲液重新悬浮细胞并使其浓度为(2～5)×105/ml。取195 μl的细胞悬液加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC，轻轻混匀后间隔3 min再加入10 μl浓度为20 μg/ml的碘化丙锭溶液。混匀后于室温避光孵育10 min。加300 μl结合缓冲液，轻轻混匀，上流式细胞仪(FACS)进行检测分析。

2结果

2.1十全大补汤含药血清对A549和A549/DDP细胞生长状态的影响倒置显微镜显示，空白血清组的A549细胞呈长梭形，成簇生长，折光性较弱；而A549/DDP细胞略呈三角形，较A549细胞形态饱满，成簇生长，折光性较弱；经DDP处理后，空白血清组、十全大补汤含药血清低剂量组细胞均明显变狭窄，突起增多，稀疏生长，或呈圆形悬浮状态，折光性较强；而经DDP处理后，十全大补汤含药血清中、高剂量组两种细胞呈长梭形或三角形，成簇生长较明显。

2.2A549和A549/DDP细胞对DDP的耐药性DDP对A549和A549/DDP细胞的IC50值分别为(5.888±0.338)μmol/L和(28.984±1.404)μmol/L，耐药指数为4.92。

2.4十全大补汤含药血清对A549和A549/DDP细胞凋亡的影响DDP处理A549细胞后早期凋亡率为(39.38±0.88)%，DDP联合中、高剂量含药血清处理分别增加细胞的早期凋亡率〔(40.64±0.35)%,(41.59±0.42)%〕(P<0.05，P<0.01)，但中、高剂量之间无差别，而DDP联合低剂量含药血清处理后细胞的早期凋亡率〔(39.48±0.56)%〕与空白血清无明显差异，但DDP联合中剂量含药血清较低剂量含药血清处理增加细胞的早期凋亡率(P<0.05)。DDP处理A549/DDP细胞后早期凋亡率为(21.75±0.96)%，DDP联合低、中、高剂量含药血清处理均增加细胞的早期凋亡率〔(23.03±0.20)%,(24.35±0.38)%,(25.41±0.61)%〕(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，但中、高剂量之间无差别，而DDP联合中剂量含药血清较低剂量含药血清处理增加细胞的早期凋亡率(P<0.05)。

3讨论

目前，西医治疗肺癌主要采取手术治疗、放射治疗、化学药物治疗及免疫(生物)治疗，但因为肺癌出现较晚且不易早期发现，80%～90%的中、晚期患者确诊时已存在着不同程度的癌细胞播散，常已失去手术根治的机会，只能行化疗；但因肿瘤较大，多数仅有姑息效果，远期疗效甚微。导致化疗失败的重要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药。铂类药物是肺癌联合化疗的核心，DDP是当前对肺癌患者单制剂化疗及联合化疗效率较高的药物之一。文献报道十全大补汤可协同顺铂的药效并减轻肿瘤患者的化疗反应〔5〕。

现代临床及实验研究均证实，顺铂多会引起不同程度的骨髓抑制和消化道反应，在症状上主要表现为虚羸少气、畏寒肢冷、食少纳差等〔6〕，属中医“气血亏虚”范畴。其病因主要是正虚邪实、药毒攻伐所致。病机为毒邪久滞、气血不畅、积聚成瘀，引起气血阻滞，正气耗伤。化疗药物破积消痈，类似中医“消法”，但攻伐太过，损伤脾胃，胃失受纳，脾失健运，气血生成不足。十全大补汤出自宋代《太平惠民和剂局方》，由四君子汤(人参、茯苓、白术、甘草)、四物汤(当归、熟地、川芎、白芍)加黄芪、肉桂组成，为气血双补的经典名方。《太平惠民和剂局方》记载：“十全大补汤治男子、妇人诸虚不足，五劳七伤，不进饮食，久病虚损，……一切病后气不如旧，……喘咳中满，脾肾气弱，五心烦闷，并皆治之。”其中人参、黄芪、熟地为主，甘温益气养血；辅以白术健脾燥湿，茯苓健脾渗湿，二药协人参、黄芪补脾肺之气，实后天气血生化之源；当归、白芍养血和营，协熟地以益心调肝生血，炙甘草和中益气，调和诸药；川芎活血行气，使补而不滞；肉桂补肾助阳，振奋阳气，鼓舞气血生长；姜枣可调和脾胃〔7〕。

本研究中低、中、高剂量十全大补汤都有增强A549/DDP细胞DDP化疗效果的作用，可能与它们促进肿瘤细胞凋亡有关。较低剂量的含药血清即可对A549/DDP细胞产生协同增效作用，而较高剂量的含药血清才对A549细胞起效，我们推测十全大补汤含药血清对DDP耐药细胞株的作用强于DDP敏感细胞株。同时，中剂量十全大补汤含药血清对两种细胞DDP化疗的协同增效作用与高剂量相当，而中剂量含药血清对两种细胞在降低耐药性和促进凋亡的作用上强于低剂量含药血清。因此，中剂量十全大补汤含药血清对DDP化疗的协同增效作用效率最高、效果最佳。

4参考文献

1郭刚，许建华.十全大补汤抑制肿瘤侵袭、转移的研究概述〔J〕.环球中医药，2011；4(1)：74-6.

2郭刚，许建华，韩建宏，等.十全大补汤对荷瘤小鼠结肠癌原发肿瘤切除后转移瘤生长及血管生成的影响〔J〕.中西医结合学报，2012；10(4)：436-47.

3张永军，包素珍，张爱琴，等.十全大补汤促进小鼠与瘤共存的实验研究〔J〕.中华中医药学刊，2009；27(6)：1308-10.

4Gao Y，Liu Z，Zhang X，etal.Inhibition of cytoplasmic GSK-3β increases cisplatin resistance through activation of Wnt/β-catenin signaling in A549/DDP cells〔J〕.Cancer Lett，2013；336(2):231-9.

5韩艳梅，曹志然，王晓辉，等.十全大补汤对移植乳腺癌小鼠化疗的减毒增效作用〔J〕.军医进修学院学报，2007；28(5)：358-9.

6潘乃群，许元.顺铂所致不良反应〔J〕.中国误诊学杂志，2009；9(7)：1756.

7陈奇.中成药名方药理与临床〔M〕.北京：人民卫生出版社，1998：19-37.

〔2014-10-20修回〕

(编辑李相军)