刘 敏，贾海红，刘 彦，律 涛，樊淑彦*

（1.河北医科大学药学院药物分析学教研室，河北石家庄050017；2.河北医科大学药学院实验中心，河北石家庄050017）

高效液相色谱法同时测定降脂灵片中4种蒽醌类成分的含量

刘 敏1，贾海红1，刘 彦2，律 涛2，樊淑彦1*

（1.河北医科大学药学院药物分析学教研室，河北石家庄050017；2.河北医科大学药学院实验中心，河北石家庄050017）

目的建立高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）同时测定降脂灵片中橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素和大黄素甲醚的含量。方法 采用HPLC测定降脂灵片中橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素和大黄素甲醚的含量，色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以甲醇－0.1%磷酸为流动相梯度洗脱（0～5 min，40∶60～70∶30；5～10 min，70∶30～80∶20；10～15 min，80∶20～90∶10；15～25 min，90∶10），检测波长286 nm，流速1.0 m L／min，进样量20μL，柱温25℃。结果在选定的色谱条件下橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚具有良好的分离度和稳定性。橙黄决明素在16.7～134 ng范围内线性关系良好，样品回收率为98.7%，相对标准偏差值（relative standard deviation，RSD）为0.3%；芦荟大黄素在11.1～89.1 ng范围内线性关系良好，样品回收率为98.5%，RSD为1.0%；大黄素在90.3～722 ng范围内线性关系良好，样品回收率为98.5%，RSD值为0.7%；大黄素甲醚在59.2～473 ng范围内线性关系良好，样品回收率为102.0%，RSD值为0.3%。结论HPLC同时测定降脂灵片中橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素和大黄素甲醚的含量，快速、简便、准确、专属性高，可以用于降脂灵片的质量控制。

降血脂药物；蒽醌类；色谱法，高压液相

降脂灵片收载于《中国药典》（2010）第一部，由制何首乌、枸杞子、黄精、山楂、决明子五味中药组成，具有补肝益肾、养血明目的作用，可用于肝肾不足型高脂血症［1］。国内文献［2］报道仅测定了何首乌中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量，检测指标较少。为了更加全面控制降脂灵片的质量，本研究建立了高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）同时测定降脂灵片中4种蒽醌类成分的含量，即决明子中橙黄决明素（Aurantio-obtusifolin，1）以及何首乌和决明子的共有成分芦荟大黄素（Aloeemodin，2）、大黄素（Emodin，3）和大黄素甲醚（Physcion，4），现将结果报告如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国Aligent 1200高效液相色谱仪，包括四元泵、柱温箱、自动控温进样器、二极管阵列检测器，Agilent化学工作站；BP211D型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 1对照品（批号111900-201303）、2对照品（批号110795-201007）、3对照品（批号110756-200110）、4对照品（批号110758-200610）均购自中国食品药品检定研究院；降脂灵片（太极集团重庆桐君阁药厂有限公司，批号1304007、1305004、1306002）；磷酸为分析纯，甲醇为色谱纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合对照品溶液配制 分别精密称取1、2、3、4对照品适量，分别置于25 m L量瓶中，并用甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度分别为83.6、92.8、113、148 mg／L的1、2、3、4对照品储备液。分别精密量取1.00、0.60、4.00、2.00 m L的1、2、3、4对照品储备液置同一25 m L量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到1、2、3、4浓度分别为3.34、2.23、18.1、11.8 mg／L的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的配制 取样品20片，去糖衣，精密称定，研细，称取1.5 g样品粉末，精密称定，置50 m L具塞锥形瓶中，加入75%甲醇25 m L，精密称定，超声30 min，冷却，用75%甲醇补足减失的质量，静置，滤过，精密量取续滤液10.00 m L，置烧瓶中，水浴蒸干，加入30%乙醇－盐酸溶液（10∶1）溶液15 m L，置水浴加热水解1 h，立即冷却，用氯仿强力振摇提取4次，每次15 m L，合并氯仿液，置水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，移置25 m L量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液既得供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液 按照处方比例，取枸杞子、黄精和山楂适量，按照制剂工艺制备缺制何首乌和决明子的空白样品，再按照供试品溶液的配制制备方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件和系统适应性试验 Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相，甲醇－0.1%磷酸，梯度洗脱（0～5 min，40∶60～70∶30；5～10 min，70∶30～80∶20；10～15 min，80∶20～90∶10；15～25 min，90∶10），流速1.0 m L／min，检测波长286 nm，进样量20μL，柱温25℃。

取混合对照品溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液在上述色谱条件下进样，记录色谱图（图1）。1～4的保留时间分别为13、14、19、24 min，分离度均＞1.5，理论塔板数均＞10 000。阴性对照不干扰含量测定。

图1 降脂灵片中4种蒽醌类成分的HPLC色谱图A.对照品；B.样品；C.阴性对照1.橙黄决明素；2.芦荟大黄素；3.大黄素；4.大黄素甲醚Figure 1 HPLC of four anthraquinones of Jiangzhiling tablet

2.3 线性关系考察 取混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件，分别进样5、10、15、20、30、40μL。记录色谱图，分别以1～4的进样量为X（ng）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。化合物1的回归方程为Y＝5.49X－2.08（r＝1.000 0）（n＝6），在16.7～134 ng范围内线性关系良好；化合物2的回归方程为Y＝1.41X－0.87（r＝0.999 9）（n＝6），在11.1～89.1 ng范围内线性关系良好；化合物3的回归方程为Y＝3.79X－4.42（r＝1.000 0）（n＝6），在90.3～722 ng范围内线性关系良好；化合物4的回归方程为Y＝1.69X－3.60（r＝1.000 0）（n＝6），在59.2～473 ng范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验 取混合对照品溶液，连续进样5次，记录色谱峰面积，得到1～4化合物的峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值分别为0.49%、0.66%、0.64%、0.67%。

2.5 稳定性试验 取样品粉末1.5 g，精密称定，按照“2.1”项下供试品溶液的配制供试品，于0、2、4、8、12 h进样测定，1～4化合物的峰面积RSD值分别为0.38%、1.10%、0.17%、0.17%。结果表明供试品溶液在室温下12 h内稳定。

2.6 重现性试验 取同一批号样品（批号1304007）5份，每份1.5 g，精密称定，按照“2.1”项下方法配制供试品溶液，分别进样测定，1～4化合物的平均含量为44.8、39.3、265、159 g／g，RSD分别为0.3%、2.1%、0.7%和0.8%。

2.7 回收率试验 取已知含量的降脂灵20片（批号1304007），研细后称取6份，每份0.75 g，精密称定后分别加入1～4对照品溶液适量，按照“2.1”项下方法制备供试品溶液，进样测定，按外标法计算得1～4的平均回收率分别为98.7%、98.5%、98.5%和 102.0%，RSD（n＝6）分别为0.3%、1.0%、0.7%和0.3%。

2.8 样品含量测定 取3批本品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，按外标法计算1～4含量，结果见表1。

表1 样品含量测定结果Table 1 DeterminationResultsof samples（n＝3，μg／g）

3 讨 论

3.1 提取方法的选择 用50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、50%甲醇、75%甲醇和100%甲醇超声［3－5］提取再进行后处理，发现75%甲醇提取样品的组分含量高且分离度良好。同时对比不同超声时间，分析显示超声时间为25 min的待测组分峰面积达到峰值，25 min后各组分峰面积均变化不大，故选择30 min为最佳提取时间。最终确定提取方法为“2.1”项下供试品溶液配制的方法。

3.2 检测波长的选择 根据文献［6－9］报道，蒽醌类化合物的测定波长为254、284、430和440 nm，本研究用二极管阵列检测器分别对1～4化合物进行全波长扫描得知，1～4的最大吸收波长分别为286、254、254、254 nm，并且对比了254、284、286、430和440 nm下各组分的吸收，结果显示286 nm下所测组分含量较大，基线平稳。同时为了兼顾各组分的检测信号和检测灵敏度，所以选择286 nm为检测波长。

3.3 流动相的选择 分别考察了乙腈－水、甲醇－水及甲醇－0.1%磷酸－四氢呋喃［10］流动相系统，发现前两种流动相系统对待测组分的分离影响没有显著差异，而甲醇－0.1%磷酸－四氢呋喃流动相未能使待测组分完全分离，分离度无法达到要求，考虑到乙腈的毒性较大且经济成本较高，故本实验选择甲醇－水流动相系统。参考有关文献［11－12］，进一步考察了添加0.1%磷酸对待测组分的影响，结果显示添加0.1%磷酸后，峰型得到了改善且基线稳定，分离度良好，故确定以甲醇－0.1%磷酸为流动相。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：856－857.

［2］ 罗定强，杨瑞瑞，裴小龙.高效液相色谱法测定降脂灵片中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量［J］.医药导报，2009，28（4）：510－511.

［3］ 王哲，许利嘉，何春年，等.HPLC测定不同来源大黄中蒽醌和二蒽酮类成分［J］.中草药，2011，42（6）：1114－1118.

［4］ 陈强.HPLC法测定复方珍珠暗疮片中大黄所含5种蒽醌苷元［J］.亚太传统医药，2013，9（10）：44－46.

［5］ 蒋午峻，王巧，袁志芳，等.高效液相色谱法同时测定决明子中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚［J］.河北医科大学学报，2006，27（4）：271－273.

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［10］ 律涛，刘敏，贾海红，等.反相高效液相色谱法测定决明降脂片中大黄素和大黄素甲醚的含量［J］.河北医科大学学报，2014，35（8）：908－910.

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（本文编辑：赵丽洁）

图2 胆囊壁增厚呈网格状改变

讨 论 胆道感染主要是胆囊炎和不同部位的胆管炎，分为急性、亚急性和慢性炎症。胆道感染主要是胆道梗阻、胆汁瘀滞造成，胆道结石是导致梗阻的最主要原因，而反复感染可促进结石形成并进一步加重胆道梗阻。急性胆囊炎是胆囊管梗阻和细菌感染引起的炎症，约95%患者有胆囊结石（呈结石性胆囊炎），5%患者无胆囊结石（呈非结石性胆囊炎）；胆囊内无结石存在，其病因仍不清楚，多见于男性、老年患者，约70%患者伴有动脉粥样硬化，其病理变化与急性结石性胆囊炎相似，但病情发展更迅速，致病因素主要是胆汁瘀滞和缺血，导致细菌的繁殖且供血减少，更容易出现胆囊坏疽、穿孔［1］。

急性胆囊炎视炎症改变的程度不同可分3型：①单纯性胆囊炎，胆囊稍肿胀，壁轻度增厚，黏膜充血水肿，胆汁正常或略混浊；②化脓性胆囊炎，胆囊肿大，囊壁充血水肿明显增厚，胆汁混浊或呈脓性，胆囊与周围组织粘连或形成胆囊周围脓肿；③坏疽性胆囊炎，胆囊极度肿大，胆囊内压力增高，可发生坏死穿孔并发局限性或弥漫性腹膜炎，坏疽性胆囊炎是胆囊炎症的一种特殊类型，极为少见，好发于老年男性及糖尿病患者，因其发病急，病情重，发展快，而又常合并内科多种疾病，且患者多为中老年人，机体功能低下，应激反应迟钝，一旦发病，则病情迅速恶化，易并发中毒性休克和多器官功能障碍综合征，重者威胁生命［2］。

急性非结石性胆囊炎是一种十分凶险的急腹症，临床少见，发病率占急性胆囊炎的4%～8%，应提高警惕，早期诊断十分重要［3］。急性非结石性胆囊炎起病急，病因复杂，术前诊断困难，易误诊，提高对本病的认识有重要的临床意义，超声检查是诊断本病的首选方法，CT也有助于诊断，早期手术切除胆囊是最重要的治疗手段［4］。

本例患者为老年男性，主要症状为腹胀、右上腹疼痛伴恶心，体征为肠鸣音活跃，可闻及气过水声，首诊为不完全性肠梗阻可以成立。但忽略了患者右上腹疼痛的症状，过分依赖腹部透视结果及肠鸣音活跃，可闻及气过水声的肠梗阻体征表现，右上腹疼痛症状因不完全性肠梗阻疾病而被掩盖，导致误诊和延误治疗。当时只是给予内科对症非手术治疗，效果不好，而后才做肝胆超声，超声的声像图表现完全符合急性非结石性胆囊炎，及时帮助临床明确了诊断，给予急诊手术，挽救了患者的生命。急性非结石性胆囊炎大多由急性胆囊炎发展而来，具有病因复杂、发病急剧、病情险恶、并发症多、治疗困难、病死率高的临床特点［5］。超声可以帮助临床明确诊断，及时制定正确治疗方案，防止严重并发症发生。

［参考文献］

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［2］ 周永昌，郭万学.超声医学［M］.3版.北京：科学技术文献出版社，1998：860.

［3］ 张业光，张华，张丽君，等.老年人急性非结石性胆囊炎的超声诊断价值［J］.基层医学论坛，2010，14（22）：731－732，封3.

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［5］ 龚念梅，王燕飞.坏疽性胆囊炎并发胆囊穿孔彩超表现1例［J］.中国超声医学杂志，2012，28（6）：860.

（本文编辑：赵丽洁）

Simultaneous determination of four anthraquinones in Jiangzhiling tablet by HPLC

LIU Min1，JIA Hai-hong1，LIU Yan2，LV Tao2，FAN Shu-yan1*
（1.Department of Phamaceutical Analysis，the School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Laboratory Center，the School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuan g 050017，China）

ObjectiveTo develop a simultaneous analysis method for Aurantio-obtusifolin，Aloeemodin，Emodin and Physcion inJiangzhiliingtablet by HPLC.MethodsDetermination of the Aurantio-obtusifolin，Aloeemodin，Emodin and Physcion inJiangzhiliingtablet by HPLC，the four constituents were separated on an Kromasil C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）using a mobile phase consisted of methanol－0.1%phosphoric acid in water at the detection wavelength of 286 nm，gradient elution program（0－5 min，40∶60－70∶30；5－10 min，70∶30－80∶20；10－15 min，80∶20－90∶10；15－25 min，90∶10），the flow rate was 1.0 m L／min，the injection volume 20μL and the column temperature 25℃.ResultsAurantio-obtusifolin，Aloeemodin，Emodin and Physcion were separated from imputities well.Aurantio-obtusifolin showed a good linear relationship in the range of 16.7－134 ng，the average recovery was 98.7%，and its RSD rate 0.3%；the range of Aloeemodin 11.1－89.1 ng，the average recovery 98.5%，and its RSD rate 1.0%；the range of emodin 90.3－722 ng，the average recovery 98.5%，and its RSDrate 0.7%；Physcion in range of 59.2－473 ng，the average recovery 102.0%，and its RSD rate 0.3%.ConclusionThe method is rapid，simple，accurate and with good reproducibility and can be used in quality control ofJiangzhilingtablet.

hypolipidemic agents；anthraquinones；chromatography，high pressure liquid

R972.6

A

1007-3205（2015）01-0052-04

2014－10－15；

2014－10－31

刘敏（1989－），女，山东微山人，河北医科大学药学院理学硕士研究生，从事药物分析研究。

*通讯作者。E-mail：fanshuyan＿ykd＠163.com；

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.019