樊留博，刘宝华，章霞，卢战，田瑛，王灵芝，马利中

（1.温州医科大学附属台州医院 康复科，浙江 台州 317000；2.温州医科大学附属第二医院 康复科，浙江 温州 325027）

·论 著·

电针联合强制性运动对脑缺血大鼠GAP-43和GFAP表达的影响

樊留博1，刘宝华2，章霞1，卢战1，田瑛1，王灵芝1，马利中1

（1.温州医科大学附属台州医院 康复科，浙江 台州 317000；2.温州医科大学附属第二医院 康复科，浙江 温州 325027）

目的：通过观察电针联合强制性运动对局灶性脑缺血大鼠灶周生长相关蛋白-43（GAP-43）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响，探讨脑缺血后电针联合强制性运动疗法促进神经功能恢复的作用及机制。方法：将SD雄性大鼠采用线栓法制作大脑中动脉阻塞（MCAO）局灶性脑缺血模型，随机平均分为模型组、强制性运动（CIMT）组、电针组和电针联合CIMT组，每组以7、14、21、28和35 d为时间点再随机平均分为5个亚组，同时设立假手术组。分别行相应治疗，以Morris水迷宫试验进行神经功能评价，分别于相应时间点取脑采用免疫组织化学方法观察每个时间点脑梗死灶周围GAP-43、GFAP阳性细胞数，Western blot法检测脑组织GAP-43、GFAP蛋白表达。结果：与假手术组比较，模型组潜伏期和穿台次数显著高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.001）。与模型组比较，CIMT组和电针组潜伏期和穿台次数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；电针联合CIMT组潜伏期和穿台次数显著低于模型组，也显著低于CIMT组和电针组，差异均有统计学意义（P＜0.001）；电针组与CIMT组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组进行比较，在14、21、28 d时电针联合CIMT组GAP-43表达显著上调，而GFAP表达显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；且电针联合CIMT组GAP-43阳性细胞数多于CIMT组和电针组，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针联合CIMT组GFAP阳性细胞数少于CIMT组和电针组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在35 d缺血区周围GAP-43表达增加、GFAP表达减少，但与CIMT组和电针组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：电针联合CIMT可促进脑梗死灶周围GAP-43的表达，抑制GFAP的表达，从而改善大鼠神经功能。

电针；强制性运动；脑梗死；生长相关蛋白-43；胶质纤维酸性蛋白；大鼠

脑梗死患者存活中约有90%遗留有不同程度的神经功能障碍，如偏瘫、失语等。神经细胞损伤后的功能恢复是神经疾病治疗的关键。因此早期客观评估神经功能障碍的严重程度并给予积极的治疗对患者的功能康复至关重要。电针联合强制性运动（constraint-induced movement therapy，CIMT）可改善脑卒中患者神经功能的康复，但其作用机制尚不清楚。目前研究表明星形胶质细胞在神经可塑性及神经再生方面与胶质纤维酸性蛋白（glial fibeillary acid protein，GFAP）和生长相关蛋白-43（growth associated protein，GAP-43）表达密切相关[1-2]。本实验通过观察电针联合CIMT对局灶周围脑组织GAP-43和GFAP表达的影响，探讨电针联合CIMT促进脑卒中运动功能恢复的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料 GAP-43和GFAP多克隆抗体（购自上海西宝生物科技有限公司）；TRITC标记的二抗（购自武汉博士德生物工程有限公司）。华佗牌针灸针（0.25 mm×25 mm，苏州医疗用品有限公司）。健康雄性SD大鼠200只（体质量220～270 g，购自浙江省医学科学院实验动物中心[许可证号SCXK（浙）20080033]）。

1.2 造模方法 采用栓线法制作大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，参照Longa法[3]并加以改良。将大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉（剂量为0.35 mL/100 g）后仰卧固定在手术台上。切开大鼠颈部正中皮肤及浅筋膜，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，分别分离左侧颈总动脉及颈外动脉、颈内动脉，将鱼线线栓头用硅胶包裹，用制备好的鱼线沿颈外动脉插至颈内动脉。动物清醒后采用Bederson法进行神经功能缺损评分，评分1～3分者为模型成功。

1.3 动物分组与处理方法 造模成功后随机分为模型组、CIMT组、电针组和电针联合CIMT组各40只，各组再随机分为术后7、14、21、28和35 d时处死5个亚组，每组8只。同时设立假手术组，除不插线外，余步骤同其他各组。模型组和假手术组动物自然饲养，不作特殊处理。其他各组分别行相应治疗。其中CIMT组于造模成功后第2天将大鼠麻醉后健侧于屈曲位用石膏绷带固定，实行每天30 min电动跑台CIMT。电针组于造模结束且动物尚未清醒时即开始针刺治疗，穴位选用“百会”、“水沟”，定位参照“实验动物穴位标准”来确定。以30号1寸毫针斜刺“百会”0.8寸，直刺“水沟”0.5寸。将针柄分别连接到G6805电针仪上，采用频率为40 Hz的连续波，刺激强度以大鼠四肢肌肉轻微抖动、安静耐受为度，时间20 min，每天1次。电针联合CIMT组于电针治疗结束后行CIMT训练，具体的相关治疗参数和方法与电针组和CIMT组相同。

1.4 Morris水迷宫试验 参照Morris水迷宫法进行定向航行实验和空间探索实验，定向航行实验评估空间学习能力，空间探索实验评估空间记忆能力，在第1～第5天进行定向航行实验，即每日将大鼠在同一象限入水点靠池壁放入水中，记录120 s内大鼠从入水到爬上对角线象限站台所需的时间，即逃避潜伏期以及搜索距离，每只大鼠每天训练2次；第6天进行空间探索实验，即撤去站台将大鼠从原入水点放入水池，记录120 s内大鼠在原站台象限游泳的时间。

1.5 GAP-43和GFAP免疫组织化学检测方法 将各组大鼠经心脏用多聚甲醛灌流固定，取脑固定脱水，石蜡包埋。脑组织放于-20 ℃冰箱中，冷冻20 min，取出后行连续冠状切片5片，置于1% TTC磷酸缓冲液中，37 ℃下恒温避光孵育20 min，脑片置于4%多聚甲醛固定，组织切片脱蜡脱水，免疫组织化学SP法检测GAP-43、GFAP，DAB显色。由另一观察者在不知分组情况下每只动物选取3张切片在400倍视野下计数GAP-43、GFAP阳性细胞数，取其平均值。

1.6 GAP-43和GFAP的Western blot检测方法 将各组大鼠处死切取梗死部分置于-80 ℃的冰箱内保存，进行组织中总蛋白的提取，置于-20 ℃保存，经蛋白定量、转膜、免疫反应、化学发光、显影、定影和图像分析后得出。

1.7 统计学处理方法 采用SPSS16.0统计软件分析。计量资料用表示，进行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫试验结果 与假手术组比较，模型组潜伏期和穿台次数显著高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.001）。与模型组比较，CIMT组和电针组潜伏期和穿台次数差距不大，电针联合CIMT组潜伏期和穿台次数显著低于模型组，也显著低于CIMT组和电针组，差异均有统计学意义（P＜0.001）；电针组与CIMT组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1-2。

表1 各组大鼠Morris水迷宫潜伏期（n=8，，s）

表1 各组大鼠Morris水迷宫潜伏期（n=8，，s）

与假手术组比：aP＜0.001；与模型组比：bP＜0.001；与CIMT组比：cP＜0.001；与电针组比：dP＜0.001

表2 各组大鼠Morris水迷宫穿台次数（n=8，）

表2 各组大鼠Morris水迷宫穿台次数（n=8，）

与假手术组比：aP＜0.001；与模型组比：bP＜0.001；与CIMT组比：cP＜0.001；与电针组比：dP＜0.001

2.2 各组大鼠不同时间点GAP-43和GFAP表达结果电针联合CIMT组与模型组进行比较，在14、21、28 d时能够显著上调GAP-43表达，差异有统计学意义（P＜0.05），且强于CIMT组和电针组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在35 d缺血区周围GAP-43表达增加，但与CIMT组和电针组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各治疗组在各时间段GFAP表达均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），电针联合CIMT与CIMT组、电针组比较在造模后14、21和28 d缺血区周围GFAP表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；但在35 d时缺血区周围GFAP表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3-6。

表3 各组大鼠在不同时间点脑缺血灶周围GAP-43阳性细胞数（n=8，，个/cm2）

表3 各组大鼠在不同时间点脑缺血灶周围GAP-43阳性细胞数（n=8，，个/cm2）

与模型组比：aP＜0.05；与CIMT组比：bP＜0.05；与电针组比：cP＜0.05

3 讨论

目前治疗脑梗死的药物仍以改善脑微循环为主，急性期溶栓虽然有效，但却受到时间窗（3～6 h）的限制，只有极少数脑梗死患者能够获得治疗机会，大多数患者神经功能缺失不可避免，因此目前研究促进大脑功能的重组和侧支再生的方法，争取最佳的康复时机，促进机体功能恢复，以减少残疾发生是一种最佳的途径。为了进一步了解电针联合CIMT促进脑梗死后神经功能恢复的内在机制，本研究建立脑梗死大鼠模型，以GAP-43、GFAP的表达为评价指标，深入研究电针联合CIMT促进脑缺血大鼠神经功能恢复的可能分子机制。

表4 各组大鼠在不同时间点脑缺血灶周围GFAP阳性细胞数（n=8，，个/cm2）

表4 各组大鼠在不同时间点脑缺血灶周围GFAP阳性细胞数（n=8，，个/cm2）

与模型组比：aP＜0.05；与CIMT组比：bP＜0.05；与电针组比：cP＜0.05

表5 各组大鼠在不同时间点脑缺血组织中GAP-43的Western blot检测结果（n=8，）

表5 各组大鼠在不同时间点脑缺血组织中GAP-43的Western blot检测结果（n=8，）

与模型组比：aP＜0.05；与CIMT组比：bP＜0.05；与电针组比：cP＜0.05

表6 各组大鼠在不同时间点脑缺血组织中GFAP的Western blot检测结果（n=8，）

表6 各组大鼠在不同时间点脑缺血组织中GFAP的Western blot检测结果（n=8，）

与模型组比：aP＜0.05；与CIMT组比：bP＜0.05；与电针组比：cP＜0.05

GAP-43又称作neuromodulin，是一个轴突膜蛋白，是一种神经特异性的蛋白质，参与神经细胞外生长及突触发育形成和神经细胞再生[4-5]。在神经元发育和再生过程中高水平表达，调解轴突延伸作用，改变细胞形态。作为细胞内信号，可大大增强与G蛋白偶联的受体转运作用。在局灶性脑缺血时，GAP-43蛋白质持续性表达，并且与大鼠的行为学恢复密切相关。在脑损伤后的重塑过程中，GAP-43对神经纤维生长、发育、再生以及突触功能维持和递质释放都起着重要作用；其不仅启动轴突的生长，引导生长锥，而且是形成复杂而严密的神经网络所必需的[6]。故GAP-43蛋白成为提高中枢神经系统可塑性和再生能力的新靶点[7]。GFAP是Eng等从多发性侧索硬化症患者脑组织中提取的，它是一种星形胶质细胞特异性的中间纤维蛋白，仅在成熟的星形胶质细胞表达。在正常动物脑灰质内，用抗GFAP免疫组织化学检测多数为阴性，神经系统受到刺激或损伤后，星形细胞表现快速反应，其标志之一是GFAP的表达，因此目前将GFAP的表达与否作为星形细胞活动状态的标志之一[8-9]。实验证明，在GFAP缺如条件下小鼠对脑缺血损伤具有更高的敏感性[10-12]。本研究表明，模型组大鼠脑梗死灶周围GAP-43及GFAP表达明显升高，在缺血7 d达到高峰，以后逐渐下降，缺血35 d后逐渐达到稳定水平，提示机体自身修复可能达到一个相对平衡状态。我们在相同时间点进行了组间对比发现，电针联合CIMT组在14、21、28 d的GAP-43表达明显高于模型组、假手术组及其他治疗组，而GFAP表达反而减少；说明GAP-43为脑损伤后中枢神经系统可塑性损伤修复的重要物质，况且在缺血早期星形胶质细胞能分泌GFAP，增强神经元对脑缺血、低氧的耐受性，其对神经元具有保护作用，促进其存活，随着时间推移GFAP表达水平趋于稳定状态，电针联合CIMT能够通过促进脑梗死灶周围GAP-43的表达，同时抑制GFAP的表达来提高中枢神经系统的自我修复能力；但CIMT组和电针组在35 d时GAP-43和GFAP表达结果差异无统计学意义，提示CIMT干预和电针干预恢复的速度是一样的。其进一步提示电针联合CIMT疗法促进神经功能恢复的作用机制，可能是通过诱导细胞表达GAP-43、抑制GFAP表达，促进神经轴突的再生，达到神经功能重塑，改善星形胶质细胞活性而实现的。

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(本文编辑：吴彬)

Effects of electroacupuncture and constraint-induced movement therapy on the expression of GAP-43 and GFAP after middle cerebral artery occlusion in rats

FAN Liubo1, LIU Baohua2, ZHANG Xia1, LU Zhan1,TIAN Ying1, WANG Lingzhi1, MA Lizhong1.
1.Department of Rehabilitation of Medical, Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University, Taizhou, 317000; 2.Department of Rehabilitation, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To observe the change of electroacupuncture and CIMT on the neural function and the expression of GAP-43 and GFAP after middle cerebral artery occlusion in rats and investigate the effect of electroacupuncture and CIMT on the neural function. Methods: MCAO was established by nylon monoflament. These rats were randomly divided into 4 group: model group, CIMT group, electroacupuncture group, and electroacupuncture with CIMT group. Then each group was randomly divided into 5 subgroups by 7 d, 14 d, 21 d, 28 d, and 35 d. Meanwhile to design a sham-operation group. The corresponding treatment was performed respectively. The evaluations included the behavior scores and Morris water maze experiment, both was to compare the recovery of neural physiological function at different time points abovementioned. Immuno-histochemical technique was used to observe the positive cells of GAP-43 and GFAP in cortical ischaemic lesions of the rats in each group at different time points. The protein expression of GAP-43 and GFAP were detected by Western blot at day after ischemia. Results: The expression of GAP-43 in gray matter of rats were obviously increased in electroacupuncture with CIMT group compared with he model group, CIMT group, and acupuncture group after 14 d, 21 d, 28 d (P＜0.05), The expression of GFAP in gray matter of rats were obviously decreased in electroacupuncture withCIMT group compared with CIMT group, electroacupuncture group after 14 d, 21 d, 28 d (P＜0.05), but no significant difference was found between CIMT group and acupuncture therapy group after 35 d (P＞0.05). Conclusion: Electroacupuncture combined with CIMT can improve neurological function of focal cerebral ischemia rats, which may be associated with the increase of GAP-43 and descrease of GFAP in peri-infarct regions.

electroacupuncture; constraint-induced movement therapy; cerebral infarction; growth associated protein; glial fbeillary acid protein; rats

R493

ADOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.03.003

2014-06-03

浙江省医药卫生科技计划资助项目（2012KYB238）；浙江省中医药科技计划资助项目（2011ZB158）；浙江省医药卫生科技计划资助项目（2010KYB124）。

樊留博（1975-），男，陕西丹凤人，副主任医师，硕士。