刘 瑞，陈福生，张秀艳*

（1.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070；2.华中农业大学环境食品学教育部重点实验室，湖北武汉430070）

橘园分离的非酿酒酵母的耐受性分析

刘 瑞1，2，陈福生1，2，张秀艳1，2*

（1.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070；2.华中农业大学环境食品学教育部重点实验室，湖北武汉430070）

为了更好地利用从橘园分离到的10株非酿酒酵母酿造果酒，对这10株非酿酒酵母的发酵力，糖、酒精和SO2的耐受性进行分析。结果显示，不同种的酵母菌发酵力不同，对酒精、糖和SO2耐受性有很大差异，其中酒精对酵母菌的抑制作用最大。2株酿酒酵母在这些耐受条件下表现良好，虽然有抑制作用，但依然能够正常生长。自分离的10株非酿酒酵母中，Candida tropicalis和C.humilis发酵力最高，Issatchenkia orientalis和Torulaspora delbrueckii能够耐受8%vol的酒精，C.tropicalis，C.humilis和T.delbrueckii能够耐受260 g/L的葡萄糖，180 mg/L的SO2。

非酿酒酵母；耐酒精能力；耐糖能力；耐SO2能力

柑橘类水果是世界上最主要的亚热带水果之一，柑橘果实营养丰富，不仅含有大量的果胶、低聚糖、有机酸等营养成分，而且含有多种人体必需的维生素、矿物质、类柠檬苦素、生物碱、挥发油类、类黄酮等具有重要生理功能的成分，使柑橘果实具有独特的风味与营养价值[1-2]。

当前果酒生产多选用酿酒酵母，优点是发酵快、耐高酒精度、高温，具有较强的竞争有限营养物的能力，但缺点是果酒风味单一[3]。早期研究大多认为非酿酒酵母不适合果酒发酵，因其耐酒精和耐SO2能力差，在果酒生产过程中完全发酵的能力不够，近年来人们发现非酿酒酵母能生成酯类、高级醇、甘油、醛和琥珀酸等影响果酒感官特点的重要成分[4-5]，据资料报道，萄葡有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）能分泌更多的高级醇和酯类[4]，报道较多的对果酒风味有积极影响的非酿酒酵母有德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii），克勒克酵母属（Klaeckera）、假丝酵母属（Candida）和毕赤酵母属（Pichia）等[6-9]。因此可以利用这10株菌单独或与酿酒酵母混合发酵以产生风味各异的柑橘果酒，也可以改善单一菌种带来的不良影响。

在果酒的酿造过程中，酿酒酵母对高浓度酒精胁迫的耐受性是果酒生产中的重要特性，耐酒精能力强的菌株可以使发酵完全、彻底，酒精达到一定浓度后会抑制酵母菌的生长，浓度过高还会使酵母菌中毒致死[10]。糖是酒精发酵的基质，也是酵母赖以生活的能源物质。但是高浓度的糖对酵母有抑制作用—葡萄糖阻遏和抑制作用。而且高渗透压会导致酵母细胞水分流失，水活性降低。此外，当培养基中糖浓度较高时，系统黏度较高，CO2释放慢[11]，添加适量的SO2，目的是抑制有害微生物生长、阻止果汁的氧化作用、加速胶体的凝集以及有利于葡萄汁澄清，在酿造过程中被广泛使用[12]。本实验选取前期研究中从橘园中分离到的160株酵母菌株，通过形态学、分子生物学方法将其归为10个酵母菌种。但目前对这些菌株的发酵力、酒精耐性、糖耐受性、SO2耐受性等并不清楚，只有控制和利用好这些条件，非酿酒酵母在果酒生产中的积极作用才能充分展现。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

10种菌为实验室自分离菌株，来自柑橘园土壤、柑橘果皮和自然发酵的柑橘汁。经分子生物学鉴定为C.tropicalis、Z.californica、H.uvarum、I.terricola、H.opuntiae、H.occidentalis、C.humilis、I.orientalis、C.lusitania e、T.delbrueckii，对照菌株为S.cerevisiae。

1.1.2 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose，YPD）：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，过滤后121℃湿热灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-IF超净工作台：苏中净化设备有限公司；UNIC-7200型可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；BL-2200H型电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；DNP-9162型电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；GI80TR型高压蒸汽灭菌锅：美国致微仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 非酿酒酵母发酵柑橘汁能力分析

非酿酒酵母发酵力分析参见韩珊珊[6]的方法。将活化好的10种非酿酒酵母和2株酿酒酵母菌株按106CFU/m L接种到30 m L柑橘汁中，以酿酒酵母作对照，28℃培养，通过称质量法计算发酵液失去的质量（即CO2释放量）。

1.3.2 耐酒精能力测定[13-15]

10 m L液体YPD培养基加入试管中，分别加入无水乙醇调整初始酒精体积分数为2%、4%、6%、8%、10%、12%，以酿酒酵母作对照，接种量106CFU/m L，28℃培养48 h，分光光度计在波长600 nm处测生物量。

1.3.3 耐糖能力测定[13-15]

用葡萄糖调整初始糖质量浓度为100 g/L、140 g/L、180g/L、220g/L，以酿酒酵母作对照，接种量为106CFU/m L，28℃培养48 h。分光光度计在波长600 nm处测生物量。

1.3.4 耐SO2能力测定[13-15]

将菌株活化，10 m L YPD培养基灭菌之后加入6% H2SO3，调整初始SO2质量浓度为40mg/L、60mg/L、80mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L、180 mg/L，以酿酒酵母作对照，接种量106CFU/m L，28℃培养48 h。分光光度计在波长600 nm处测生物量。

1.35 抑制率的计算

2 结果与分析

2.1 10株非酿酒酵母发酵柑橘汁能力分析

图1 不同非酿酒酵母发酵柑橘汁的能力Fig.1 Fermentation ability of different non-Saccharomyces

从图1可以看出，2株S.Cerevisiae分别在24 h和36 h达到最大发酵力，达到最大发酵力的时间先后顺序是Angel S.cerevisiae＞France S.cerevisiae，C.tropicali s，I.terricola，H.opuntiae，C.humilis，H.occidentalis，T.delbrueckii＞H.uvarum＞I.orientalis＞Z.californica＞C.lusitaniae。从发酵力的高低来看，S.cerevisiae＞C.hum ilis＞H.opuntiae＞H.uvarum，H.occidentalis，T.delbrueckii＞C.tropicalis＞C.lusitaniae＞I.terricola＞I.orientalis＞Z.californica。从发酵能力持续时间上来看，2株S.cerevisiae持续时间短，仅有48 h，而T.delbrueckii的发酵能力持续时间长，达84 h。菌种发酵能力持续时间：T.delbrueckii＞C.tropicalis，H.uvarum，H.opuntiae，C.humilis，H.occidentalis＞I.terricola，C.lusitaniae＞S.cerevisiae＞I.orientalis，Z.californica。结果表明，10株非酿酒酵母的发酵力不及酿酒酵母，进入快速发酵期时间较长，但是酿酒酵母在发酵力达到最大后，发酵能力迅速下降，而C.tropicalis，H.uvarum，H.occidentalis和T.delbrueckii却能持续发酵。

2.2 10株非酿酒酵母耐酒精能力分析

从图2可以看出，所有酵母菌株的生长会随着酒精度的增加而降低。但不同酵母耐受的最大酒精度不同，酿酒酵母在酒精度为12%vol的条件下仍能生长，而非酿酒酵母中，C.tropicalis和I.orientalis，T.delbrueckii在酒精度＞6%vol时生长量有明显的抑制作用。C.hum ilis和T.delbrueckii在酒精度＜8%vol的条件下生长抑制率分别为55%、70%，这两株菌在非酿酒酵母中耐受力最强。Z.californica，H.uvarum，I.terricola，H.opuntiae和H.occidentalis在酒精度为6%vol时，抑制率达100%。

图2 10株非酿酒酵母耐酒精能力Fig.2 Ethanol tolerance of ten non-Saccharomyces

2.3 10株非酿酒酵母耐糖性能分析

图3 10株非酿酒酵母耐糖能力Fig.3 Glucose tolerance of ten non-Saccharomyces

从图3可以看出，随着初始葡萄糖质量浓度的增加，酿酒酵母和非酿酒酵母的生长会不同程度的受到抑制。酿酒酵母和C.tropicalis、C.humilis、T.delbrueckii在260 g/L高糖质量浓度条件下依然能够正常生长，抑制率为25%。Z.californica、H.uvarum、I.terricola、H.opuntiae、H.occidentalis、I.orientalis和C.lusitaniae这7株酵母达到50%抑制率（用来反应对糖的耐受性高低）所需糖质量浓度依次是160 g/L、180 g/L、220 g/L、160 g/L、200 g/L、260 g/L、220 g/L。

2.4 10株非酿酒酵母耐SO2能力分析

图4 10株非酿酒酵母耐SO2能力Fig.4 SO2tolerance of ten non-Saccharomyces

从图4可以看出，随着SO2含量的增加，酵母的生长都不同程度的受到抑制，非酿酒酵母对SO2耐受性要差于酿酒酵母，各SO2含量条件下生长量都低于酿酒酵母。在非酿酒酵母中，Z.californica和有孢汉逊酵母属的3种菌（H.uvarum，H.opuntiae，H.occidentalis）耐受力最差，C.tropicalis，C.humilis，I.terricola，I.orientalis和T.delbrueckii，对SO2有较高的耐受性，在180 mg/L的SO2含量条件下抑制率为30%。

3 结论

综上所述，不同种的酵母菌发酵力不同以及对酒精、糖和SO2耐受性有很大差异，其中酒精对酵母菌的抑制作用最大。已经商业应用的两株酿酒酵母在这些耐受条件下表现良好，虽然有抑制作用，但依然能够正常生长，而自分离的10株非酿酒酵母中，C.tropicalis和C.humilis发酵力最高，I.orientalis和T.delbrueckii能够耐受8%vol的酒精度，C.tropicalis，C.humilis和T.delbrueckii能够耐受260 g/L的葡萄糖，180mg/L的SO2。C.lusitaniae耐受6%vol的酒精度，260 g/L的葡萄糖，180 mg/L的SO2。Z.californica，I.terricola和3株有孢汉逊酵母属的菌株（H.uvarum，H.opuntiae和H.occidentalis），在4%vol的酒精度条件下不能生长，在220 g/L的糖含量、180 mg/L的SO2含量条件下，达到耐受极限。因此在后续的实验研究中，可以根据各个菌的耐受能力调整初始糖度，SO2含量，根据发酵能力的大小控制接种量，根据酒精耐受能力确定混合发酵中非酿酒酵母的接种时间。

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Stress tolerance of non-Saccharomyces isolated from orangery

LIU Rui1,2,CHEN Fusheng1,2,ZHANG Xiuyan1,2*
(1.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China;2.Key Laboratory of Environment Correlative Dietology,Ministry of Education,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

In order to make better use of non-Saccharomyces isolated from orangery on fruit winemaking,the fermenting power and tolerance of glucose,ethanol and SO2of the strains were analyzed.The results showed that there were evident differences in tolerance among all the measured yeast strains,and tolerance of alcohol on yeast was the maximum.Two S.cerevisiae presented good tolerance,whereas the tolerance of non-Saccharomyces was inferior.From the isolated 10 non-Saccharomyces,Candida tropicalis and C.humilis showed the highest fermenting power,Issatchenkia orientalis and Torulaspora delbrueckii can tolerate 8%vol ethanol,C.tropicalis,C.humilis and T.delbrueckii can tolerate 260 g/L glucose and 180 mg/L SO2.

non-Saccharomyces;ethanol tolerance;glucose tolerance;SO2tolerance

Q 93-336

A

0254-5071（2015）03-0020-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.005

2014-12-20

国家自然科学基金资助（31071588）；高等学校博士学科点科研专项基金（200805041071）

刘瑞（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：张秀艳（1973-），女，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。