鲁葆春，杨建辉

新型大鼠急性重症胆管炎模型的建立

鲁葆春，杨建辉

目的：探讨建立非活动限制、可复性大鼠急性重症胆管炎（SAC）模型。方法：26只大鼠随机分为SAC造模组和假手术组，两组均进行颈外静脉置管建立无拘束模型，采用胆总管置入麻醉导管，远端结扎，导管内注入内毒素后封管留置。SAC组于胆总管结扎后0、24、48、72 h监测胆总管压力；分别于胆总管注射内毒素后0、12、24、48 h采静脉血检测TBIL、ALT、TNF-α；术后24 h、72 h各取肝脏行病理学检查。结果：SAC组随着造模时间的延长，胆总管压力逐渐提高，不同时点间存在显著性差异(P＜0.05)；血清TBIL、ALT，TNF-α水平逐渐上升，不同时点均明显高于假手术组相应时间点(P＜0.05)；病理学检查证实肝脏病理改变明显。结论：新型大鼠SCA模型能够模拟临床，基本能反映人SAC的早期病理过程，也适合SAC术后进一步的实验性研究。

胆管炎；模型建立；大鼠

重症急性胆管炎(severe acute cholangitis，SAC)是在胆道完全梗阻基础上发生的一种严重急性胆道感染，存在着细菌易位和肠源性内毒素血症，具有起病急骤，发展迅速，病情凶险，死亡率高的特点[1]。目前的SAC动物模型多用大鼠制作，造模方法多样，其中最成熟的模型是胆道完全梗阻并注入细菌或内毒素的大鼠模型，而该类模型系不可复性，不能模拟临床上SAC解除胆道梗阻后的研究。鉴于此，本实验利用临床上常用的硬膜外麻醉导管，建立非活动限制大鼠SAC可复性模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用二级清洁健康SD大鼠（浙江省实验动物中心提供）26只，雄性，体质量227～385 g。标准颗粒混合饲料（浙江省实验动物中心提供）喂养，实验期间禁食，静脉给予葡萄糖4.5 mg·kg-1·min-1（动物中心合格证号：SYXK浙2009N0139）。

1.2 导管制备 选用人外径约0.9 mm的硬膜外麻醉导管（规格F3，购于浙江海圣医疗器械有限公司），并从近端（即钝头，含侧孔）剪下长约5 cm，远端连接带有封帽的注射组件，用于胆总管留置导管。余段用于颈外静脉置管，其近端加热并略拉长，使其变软为平口，防止刺穿血管壁，远端组件接微电脑数字式注射泵。

1.3 模型建立及动物分组 将大鼠按月龄、体质量两两配对后随机分成假手术组(n=13)、SAC模型组(n=13)。置管前禁食6 h，自由饮水。1%的戊巴比妥（50mg/kg）腹腔内注射麻醉，解剖出右颈外静脉后，远端结扎。剪开颈外静脉，用眼科钳夹住血管壁置入麻醉导管，深度约3～4 cm，双线固定。导管由颈背部皮肤引出，穿行于弹簧螺旋管内，弹簧近端用蝴蝶夹固定于颈背部皮肤，另一端固定于饲养笼外的支架。导管外端接一微电脑数字式注射泵，备为造模术中、术后连续3 d输液及采血。

假手术组：无菌条件下进入腹腔，钝性剥离胆总管周围组织，关腹。

SAC模型组：无菌条件下进人腹腔，在胆总管距左右肝管汇合处以远1 cm剪开胆管，远端双线结扎，近端插入所制备的麻醉导管，插入深度约6mm，妥善固定，将导管外侧端经切口导出体外。确定胆汁排出通畅，向导管内缓慢注入大肠杆菌内毒素(O55B5)10 mg/kg，再注射空气0.2 mL，带肝素的封帽封闭导管。

1.4 检测指标和方法

1.4.1 胆总管压力监测 SAC模型组于胆总管结扎后0、24、48、72 h，5号头皮针穿刺胆总管留置导管，接MX9505T型压力传感器监测胆总管压力，cmH2O表示[2]。

1.4.2 实验室检测 分别于胆总管内注射内毒素后0、12、24、48 h采静脉血，用雅培Aeroset全自动生化分析仪检测血清胆红素(TBIL)，谷丙转氨酶(ALT)；利用双抗夹心免疫酶联吸附试验(ELISA)法测定血清肿瘤坏死因子(TNF-α)。

1.4.3 肝脏组织病理检查 于造模后24 h各组随机处死4只大鼠，分别取肝组织置于10%甲醛溶液中固定24 h后常规石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察。72 h各组处死所有大鼠，以同样方法进行病理学观察。

2 结果

2.1 一般情况 所有大鼠均于术后1 h内清醒，SAC模型组12 h出现疲倦，双眼灰黄无光泽；24 h蜷伏，口唇青紫，不饮不食，少尿，尿色深黄。假手术组清醒后正常饮水，活动稍减少，12 h后一般情况与手术前无明显差异。所有大鼠处死时打开腹腔观察，无一导管脱落及胆漏情况。

2.2 胆总管压力 SAC模型组随着造模时间的延长，胆总管压力逐渐提高，不同时点间存在显著性差异(P＜0.05)，详见表1。

表1 SAC模型组不同时点胆总管压力比较

2.3 两组各时点TBIL，ALT，NF-α的变化见表2。

表2 假手术组与SAC模型组各时点TBIL，ALT，TNF-α的变化

2.4 肝脏组织病理改变 假手术组各时点肝脏组织病理均未见明显异常；SAC模型组24 h后肝脏表面偶有圆形黄色脓点1～2个，直径小于2 mm；72 h后肝脏表面黄色脓点明显增多，肝脏肿大。镜下观察，SAC模型组24 h后，肝细胞轻度水肿伴脂肪变性，汇管区有炎细胞浸润；造模后72 h可见肝细胞小片状坏死，肝细胞脂肪空泡增多、变大，汇管区炎细胞浸润明显。

3 讨论

SAC由胆管梗阻合并胆汁细菌感染引起，胆管梗阻后胆道内压力增高，胆汁瘀积，细菌大量繁殖，高压脓性胆汁反流到门静脉和肝周围淋巴管将引起全身的脓毒血症。建立SAC动物模型有多种方法，直接注菌法仅模拟了感染的单一因素，造模效果差[3]。上世纪末出现的完全梗阻模型[4-6]，即胆道完全梗阻并注入细菌，造模效果可靠，病理改变明显。但在进一步研究时需进行二次手术解除梗阻，增加了操作难度，创伤重，死亡率高[7-8]。寇丽等[9]提出不完全梗阻性胆管炎模型，即经十二指肠乳头向胰胆管逆行插入硅胶管，并结扎固定，注入细菌后夹闭硅胶管，依靠硅胶管的支撑作用，胆管仍可保持部分通畅。此模型较难控制硅胶管结扎固定的松紧度，过紧硅胶管不易拔除，过松胆管梗阻不明显，同时十二指肠壁有刺孔，增加了腹腔感染的机会。智绪亭等[10]建立了可复性模型，通过在胆总管后壁置一带有丝线的乳胶管并戳孔两端引出体外控制梗阻与再通，其病理变化与临床梗阻性黄疸一致，但同样存在梗阻程度不易控制且增加额外感染的缺点。石铮等制作了家兔SAC模型[11]，陈钟[12]等制作了犬SAC模型，也有报道应用马制作SAC模型[13]，这类模型均采用结扎胆总管远端，胆总管内置管引出腹壁外，导管内注入细菌后夹闭，此类方法造模置管妥善、易于控制梗阻，更接近于临床，但实验费用较大，阻碍了实验大规模开展，同时实践中也存在较大动物限制问题。

本实验采用大鼠制作SAC模型，采用结扎胆总管远端，胆总管内置硬膜外麻醉导管并引出腹壁外，导管内注入内毒素后后夹闭。采用的硬膜外麻醉导管易获得，带有刻度，易于掌握置管深度，经制备多用途使用。操作中首先建立了颈外静脉输液系统，并应用弹簧螺旋管固定大鼠，实现了大鼠术后活动不受限制，并为术后持续输液、多次血标本采集提供了保障。

大鼠胆总管周围为胰腺组织所包围，胰腺分泌管汇合成大导管汇入胆总管，为避免造成胰腺损伤，胆总管置管位置距肝门左右肝管汇合处较短，仅1.0 cm。且胆管壁菲薄，置管困难，且在胆道高压力的情况下容易发生胆漏，这是大鼠胆管内留置导管操作的难点。人硬膜外麻醉导管头端细小圆钝，加之因盘曲所形成的自然弧度，对置管带来方便，更使刺破、拉断胆总管的可能性减少。我们妥善固定胆总管内导管，采取近端丝线两道，远端原胆总管结扎线再两道固定，术中直视下注射内毒素时未见有渗漏，术后解剖腹腔亦未见一例导管脱出、胆道拉断及胆漏情况。应用带有封帽的组件封闭导管，整个操作无菌、灵活，管道密闭，胆道额外污染减少，明显提高了制模成动率。

本实验结果显示，SAC模型组胆总管的压力术后逐渐增加，术后72 h上升至（11.1±0.7）cmH2O；与假手术组比较，各时点血清TBIL水平显著升高(P＜0.05)，术后48 h达到（108.3±27.5）μmol/L。正常大鼠胆道压力4.5 cmH2O左右，血清中胆红素水平仅为4μmol/L左右[2]，当胆总管梗阻时，整个胆道系统内的压力因胆汁淤积而显著增高，导致连接毛细胆管与细胆管的Hering壶腹发生机械性破裂，胆汁乃直接进入淋巴系统，加之肝细胞的胆汁分泌障碍，梗阻性黄疸形成。既往完全梗阻模型研究中，胆总管内选择注射了大肠埃希菌，结局是胆汁、血培养细菌阳性，与注射细菌一致，肝组织病理提示有坏死灶，并有脓点。本实验模型组选择注射了内毒素，而非菌液，是基于脓毒血症是SAC有较高病死率的重要原因，诱发多脏器功能衰竭综合症感染因素中，细菌内毒素的作用可能比细菌更重要。在临床上可见脓毒性休克患者血清中无细菌学证据，而往往存在内毒素血症和高水平TNF-α[1、14]。其中内毒素诱发的多种细胞因子在脓毒血症的发生和发展中起重要作用，本实验结果表明内毒素SAC模型组术后各时点血清TNF-α指标水平明显高于假手术组(P＜0.05)，可能的机制是SAC时胆汁淤积易诱发对LPS超敏反应，肝细胞内毒素受体CD14的表达进行性增强，从而经激活TLR4下游信号途径，使NF-κB激活进入细胞核，指导靶基因的转录，TNF-α等炎症因子的表达进行性增强[15]。炎症因子也加剧肝脏组织炎症细胞浸润并使肝细胞变性、坏死。本实验SAC模型组各时点血清ALT水平显著高于假手术组(P＜0.05)；肝脏病理于造模后24 h即有肝细胞轻度水肿伴脂肪变性，炎细胞浸润；造模后72 h可见肝细胞小片状坏死，肝细胞脂肪空泡增多、变大，汇管区炎细胞浸润明显。

本动物模型与临床相近，基本能反映人SAC的早期病程和病变，因保留了胆总管内插管，也适合SAC术后进一步的实验性研究。而本实验未能设计单纯梗阻组对照，也未能测定胆汁、血液内毒素水平，形成不足之处，需要进一步研究改进。

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（收稿：2013-12-26 修回：2014-12-12）

（责任编辑 赵连根）

Estab lishm ent of a Novel Rat M odel of Severe Acute Cholangitis

YANG Jian-hui,LU Bao-chun Depart-ment of Hepatobiliary Surgery,Shaoxing People's Hospital,Shaoxing(312000),China

Objective To establish a novel ratmodel of severe acute cholangitis(SAC).MethodsTwenty-six rats were randomly divided into two groups:model group and shem operated group．All rats were unrestrained and performed with epidural anesthesia catheter used as the filling materials into vena jugularis externa. SACmodels were established by placing epidural anesthesia catheter into common bile duct and ligating the distal bile duct,then inside injecting LPS and closing the catheter.The level of common bile duct pressure was measured at 0,24,48,72 h after the ligation.The changes of TBIL,ALT,TNF-αwere observed at 0,12,24,48 h after the injection.Pathological changes of liver tissues were observed.ResultsThe level of common bile duct pressure increased gradually after the ligation.Serum TBIL,ALT,TNF-αlevel in model group were progressive increased and higher than shem operated group(P＜0.05).Marked liver pathological changes were observed in model group.ConclusionThismodel can reflect the early course of SAC and be used in the further studies of SAC postoperative.

Cholangitis;model construction;rats

Q95-33；R657.4+5

A

1007-6948(2015)01-0045-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.01.014

浙江省公益性技术应用研究计划项目（2011C33023）

浙江省绍兴市人民医院普通外科（肝胆胰脾）（绍兴 312000）

鲁葆春，E-mail：lbc111@net.com