隋铁泉，张志伟，杨 涛，滕洪生，杨 洋，张秀强

细胞跨膜Notch配体4在非小细胞肺癌中的表达及意义

隋铁泉，张志伟，杨 涛，滕洪生，杨 洋，张秀强

目的：检测非小细胞肺癌中细胞跨膜Notch配体4（DLL4）的表达，探讨其与临床病理参数的关系、临床意义及两者的相关性。方法：采用免疫组化Envison法检测58例非小细胞性肺癌的组织标本及同时切取的58例癌旁正常组织中DLL4的表达情况。结果：DLL4在非小细胞肺癌组织中表达的阳性率为75.9%（鳞癌77.3%，腺癌75.0%），明显高于癌旁正常组织（阳性率为29.3%），两组间比较χ2=11.74（P＜0.01）；DLL4在非小细胞肺癌组织中的表达与肿瘤的大小、临床分期及淋巴结转移密切相关（P＜0.05），其在非小细胞肺癌组织中的表达与患者的性别、年龄及肿瘤的组织类型无关（P＞0.05）。结论：DLL4在非小细胞肺癌和正常肺组织中的表达差异有统计学意义，其可能参与了肿瘤新生血管发生，参与非小细胞肺癌的侵袭和转移，从而影响患者的预后。

非小细胞肺癌；细胞跨膜Notch配体4；蛋白表达

随着我国环境污染加剧，肺癌发病率已经位居第二位[1]。非小细胞肺癌是肺癌中发病率最高的病理类型[2]。目前针对肿瘤血管生长的靶向治疗已经成为肿瘤治疗研究的热点[3]。Delta-Notch信号通路尤其是作为跨膜Notch配体之一的Delta-like ligand 4（DLL4）被认为是调节肿瘤血管的一个重要机制[4]，既往研究表明肿瘤细胞可能通过自身分泌DLL4这一配体蛋白与血管内皮细胞上的notch受体跨膜结合，来调控血管新生和发育成熟[5]。本研究收集2006年1月—2012年3月天津市肿瘤医院及天津市第五中心医院经病理检查证实为非小细胞性肺癌的58例组织标本，检测非小细胞肺癌组织中DLL4的表达，探讨其与非小细胞肺癌病理参数的关系及其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本组共58例，术前均未经放疗、化疗及内分泌等治疗。男31例，女27例；年龄37～78岁，中位年龄51岁。肺鳞癌22例，肺腺癌36例。肺癌UICC2009标准分期I期12例，II～III期46例。有淋巴结转移39例，无淋巴结转移19例。同时切取取上述手术切除标本边界5 cm以上的正常肺组织作对照。所有病理标本经两位高年资病理科医生复诊确认。

1.2 主要试剂和方法

1.2.1 试剂 兔抗人DLL4多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）抗体稀释液和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2.2 免疫组化染色 采用Envison两步法：取上述存档的石蜡组织块，连续组织切片，厚4μm，常规HE染色及免疫组织化学染色。免疫组织化学染色按试剂盒说明书操作，DLL4抗体稀释度为1∶1000。用已知阳性片和PBS代替一抗分别作阳性和阴性对照。

1.3 结果判定方法 以胞浆和（或）胞核内明显的黄色或棕黄色颗粒为阳性染色。两名病理医师独立观察，选染色均匀肿瘤区10个高倍视野，以阳性细胞百分率为判定标准。阳性细胞＜20%为阴性（-），20%～40%为弱阳性（+），40%～60%为阳性（++），≥60%为强阳性（+++）。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，肿瘤组织与正常组织之间的比较用两独立样本的t检验，各组间的比较用方差分析，组间均值两两比较用最小差异法，肺癌中DLL4的表达与临床病理特征的关系用多因素方差分析。P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 DLL4在肺癌组织中的表达 DLL4的阳性表达位于肺腺癌和肺鳞癌肿瘤细胞的胞浆或胞膜，呈棕黄色或棕褐色。58例肺癌组织中44例表达阳性，14例为阴性，阳性率75.9%。正常58例癌旁肺组织中17例呈阳性，阳性率29.3%。两组间阳性表达率相比差异有显著性(χ2=11.74，P＜0.01)（图1～4）。结果见表1。22例鳞癌中，17例阳性，5例阴性，阳性率77.3%。36例腺癌中27例阳性，9例阴性，阳性率75.0%。两组间无明显统计学差异（χ2=0.43，P＞0.05）。见表2。

图1 肺腺癌免疫组化显示DLL4的阳性表达（DAB显色，×200）

图2 肺腺癌癌旁组织免疫组化显示DLL4的阴性表达（DAB显色，×200）

图3 肺鳞癌免疫组化显示DLL4的阳性表达（DAB显色，×200）

图4 肺鳞癌癌旁组织免疫组化显示DLL4的阴性表达（DAB显色，×200）

表1 DLL4蛋白在肺鳞癌和肺腺癌组织中的表达

表2 DLL4蛋白在肺癌和癌旁组织中的表达

2.2 DLL4在非小细胞肺癌中的表达与各临床病理参数之间的关系 DLL4在非小细胞肺癌组织中的表达与肿瘤的大小、临床分期及淋巴结转移密切相关（P＜0.05），其在非小细胞肺癌组织中的表达与患者的性别、年龄及肿瘤的组织类型无关（P＞0.05）。见表3。

表3 肺癌中DLL4表达与临床病理特征间的关系

3 讨论

美国科学家Folkman[6]首先提出肿瘤的生长与浸润依赖于肿瘤新生血管生成的理论。经过近30年的研究，这一理论已经被越来越多的实验所证实。Notch信号通路是参与调解哺乳动物血管形成和肿瘤生长的重要信号通路[7-8]。Notch信号通路由Notch受体、Notch配体和DNA结合蛋白（CSL）三部分组成。Notch为分子量约300 KD的蛋白质，果蝇只有1个Notch基因，人类4个（Notch1-4）。有研究[9-10]发现，Dll4是存在于内皮细胞的唯一特异Notch配体，在正常组织和肿瘤组织的血管生长过程中都起到重要的作用。本研究发现，Dll4在非小细胞肺癌中的表达明显高于癌旁正常组织（P＜0.01），从而提示DLL4可能参与非小细胞肺癌的发生、发展。本研究还证实，DLL4的表达与非小细胞肺癌的大小，淋巴结转移和临床分期密切相关，提示DLL4可能参与了非小细胞肺癌的侵袭和转移。这可能与DLL4-Notch信号通路对肿瘤血管发生有重要作用有关。综上，DLL4有可能成为判断非小细胞肺癌侵袭和转移的指标之一。

目前，抗肿瘤血管发生已经成为一种抗肿瘤治疗的新策略。经过多年研究，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）已经被证实对肿瘤血管的生成有重要作用。部分VEGF抑制剂已经应用于临床。但研究发现，抗VEGF药物面临耐药、疗效不佳等问题[11]。有研究表明，成熟血管比例较高的肿瘤对VEGF之类的抗血管生成的治疗效果不佳，可能与成熟血管外膜对VEGF的缺乏有保护作用有关。然而，DLL4-Notch信号通路的作用是双方面的，一方面其促进血管发育和成熟，从而改善肿瘤血管的结构和功能，促进肿瘤的生长；另一方面其通过抑制血管的过度增殖减少肿瘤血管数量[12]。有研究[13]发现，阻断DLL4-Notch信号通路可导致肿瘤生成过多的无效新生血管，这种无效的新生血管反而可以延缓和抑制肿瘤的生长，并对VEGF耐药的肿瘤同样有效。因此，DLL4-Notch信号通路有可能成为非小细胞肺癌血管靶向治疗的新靶点。

[1]尹晓东，吴晓静，牛静秀，等.中药联合放射治疗非小细胞肺癌的观察[J].中国中西医结合外科杂志,2013,19(6):621-624.

[2]鲍传明，王志维.60岁以上老年肺癌患者手术与非手术治疗的预后分析[J].中国中西医结合外科杂志,2013,19(5):566-567.

[3]杨国才,雨山,徐广全.青藤碱对肺癌A549细胞增殖的抑制作用[J].中国中西医结合外科杂志,2011,17(5):482-485.

[4]Patel NS,Dobbie MS,Rochester M,et al.Up-regulation of endothelial delta-like-4 expression correlates with vessel maturation in bladder cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(6):4836-4884.

[5]Patel NS,Li JL,Generali D,et al.Up-regulation of delta-like-4 ligand in human tumor vasculature and the role of basal expression in endothelial cell function[J].Cancer Res,2005,65(19):8690-8697.

[6]Folkman J,Klagsbrun M,Vascular physiology.A family of angiogenic peptides[J].Nature,1987,329(6164):671-672.

[7]Bray SJ.Notch signalling:a simple pathway becomes complex[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2006,7(9):678-689.

[8]Cristofaro B,Emanueli C.Possible novel targets for therapeutic angiogenesis[J].Curr Opin Pharmacol,2009,9(2):102-108.

[9]Scehnet JS,Jiang W,Kumar SR,et al.Inhibition of DLL4-mediated signaling induces proliferation of immature vessels and results in poor tissue perfusion[J].Blood,2007,109(11):4753-4760.

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[11]Jain RK,Duda DG,Clark JW,et al.Lessons from phase III clinical trials on anti-VEGF therapy for cancer[J].Nat Clin Pract Oncol, 2006,3(1):24-40.

[12]Hellstrom M,Phng LK,Hofmann JJ,et al.DLL4 signaling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis[J].Nature,2007,445(7129):766-780.

[13]Ridgway J,Zhang G,Wu Y,et al.Inhibition of DLL4 signaling inhibits tumor growth by deregulating angiogenesis[J].Nature,2006,444 (7122):1083-1087.

（收稿：2014-08-02 修回：2014-12-20）

（责任编辑 李志刚）

Expression and Clinical Significance of Delta-like Ligand 4 in Non-small Cell Lung Cancers

SUI Tie-quan,ZHANG Zhi-wei,YANG Tao,et al.Department of Cardiothoracic Surgery,The Fifth Central Hospital of Tianjin,Tianjin(300450),China

Objective To study the expression of Delta-like ligand 4(DLL4)in non-small cell lung cancer and normal tissue and the relationship with patients’clinical characteristics.MethodsExpression of DLL4 was detected in 58 cases of non-small cell lung cancer tissue and 58 cases of normal lung tissue by immunohistochemical Envision method.ResultsThe masculine expression rate of DLL4 in non-small cell lung cancer tissue was 75.9%.The positive expression rate of DLL4 in Non-small cell lung cancer tissue was higher than that in normal lung tissue.The expression of DLL4 in Non-small cell lung cancer tissue was associated with the diameter,clinical staging and lymph node metastasis closely(P＜0.05),but not with gender,age and pathological pattern(P＞0.05).ConclusionThe expression of DLL4 in Non-small cell lung cancer tissue and in normal tissue was different.The expression of DLL4 involved in invasion and metastasis of non-small cell lung cancer will have an influence to the prognosis of patients.

Non-small cell lung cancer;delta-like ligand 4;protein expression

R734.2

A

1007-6948(2015)01-0010-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.01.003

天津市第五中心医院胸外科（天津 300450）

隋铁泉，E-mail：tianjinsui@sina.com