魏 巍，崔乃强，刘洪斌，张淑坤，李东华

实验研究

重症急性胰腺炎大鼠的早期细菌移位

魏 巍1，崔乃强2，刘洪斌3，张淑坤3，李东华3

目的：建立大鼠重症急性胰腺炎（SAP）模型，观察FITC标记的大肠杆菌突破肠屏障及其发生细菌移位的时间及途径。方法：健康雄性Wistar大鼠50只，随机分为SAP组（n=30）和假手术组（n=20）；造模前3 h用FITC标记的大肠杆菌给大鼠灌胃，分别在造模后2、3、4、6、8 h处死动物，分别取胰腺、肠系膜淋巴结制备组织匀浆；另取门静脉血及腹水，离心取上清，荧光化学发光检测仪检测标本中FITC的荧光强度，确定细菌移位出现的途径及时间。结果：与假手术组相比，SAP组于造模后3 h在腹水，4 h在胰腺组织，6 h在肠系膜淋巴结中检测出较高强度的荧光（P＜0.05），并以腹水中的荧光强度为最高；门静脉血至造模后8 h仍未检测到细菌移位。结论：腹水和淋巴液可能是SAP早期细菌移位的重要途径，细菌可通过上述途径早期发生移位。

重症急性胰腺炎；早期；细菌移位

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)来势凶猛,死亡率高达20%～30%[1]，研究表明，病人死亡的时段主要集中在全身炎性反应期(systemic inflammatory response syndrome，SIRS）和全身感染期（systemic sepsis,SS）[2-3]。细菌移位是导致SAP感染性并发症的重要原因[4]。肠道作为机体应激的中心器官之一，早期即可能出现肠屏障功能损伤[5]，肠道细菌的过度增长和机体防御功能的损伤共同促进了肠道菌群移位。本研究以异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的大肠杆菌做为示踪物，研究SAP大鼠模型发生细菌移位的时间及途径。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 雄性健康Wistar大鼠50只，体质量（250±30）g，由中国医学科学院放射医学研究所提供，动物合格证号为scxk津2005-001。到达后常规饲养1周后，数字随机表法随机分为SAP组（n= 30）和假手术组（n=20）。

1.2 主要试剂与仪器 大肠杆菌ATCC25922（中国生物与药品质量检定所）；牛磺胆酸钠（美国Sigma公司）;FITC进口分装;荧光显微镜 (日本nikon公司)；荧光化学发光检测仪（美国Thermo公司）。

1.3 荧光菌的标记 将大肠杆菌经18～24 h增殖至对数生长期，PBS洗涤2次。用碳酸盐缓冲液配成浓度为5×109/mL的悬液。加入DMSO配成的FITC溶液，使FITC在菌液中的终浓度为5μg/mL。置37℃温箱保存1.5 h，取出低温离心，弃除上清，用PBS液洗涤细菌2次，避光保存于4℃。在光镜及荧光显微镜下观察大肠杆菌，确认90%的细菌成功标记。

1.4 模型建立 禁食不禁水12 h。手术前3 h用标记成功的大肠杆菌灌胃（0.8 mL/kg）。采用胆胰管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠制备SAP动物模型[6]，假手术组以同样的方法逆行注射生理盐水(0.1mL/100 g)。

1.5 标本留取 于模型制备后2 h、3 h、4 h、6 h、8 h麻醉，模型组每时间点随机取6只大鼠，假手术组每时间点随机取4只大鼠，均无菌条件打开腹腔，收集腹水1mL。取胰腺组织和肠系膜淋巴结各0.2 g，保存于-20℃冰箱。门静脉采血1 mL于柠檬酸钠抗凝试管。距回盲部4 cm处取末端回肠6～8 cm，用生理盐水冲洗肠腔。

1.6 FITC标记菌荧光的检测 取门静脉血300μL，立刻放置荧光化学发光检测仪中做荧光强度检测。分别取胰腺、肠系膜淋巴结各0.2 g，肠系膜淋巴结用生理盐水冲洗，滤纸吸干，制备成10%的组织匀浆，离心机离心（1500 r/min，10 min）。精密量取上清液300μL以荧光化学发光检测仪检测荧光强度(Ex485 nm，Em530 nm)，结果以每毫升相对荧光强度单位（rlu/mL）表示。腹水FITC标记菌荧光的检测方法同门静脉血。

1.7 统计学处理 用SPSS 15.0软件进行统计，所有计量数据用(±s)表示，其中组内各时段用单因素方差分析，两两比较用q检验，组间对比用t检验。P＜0.05为统计学有显著性差异。

2 结果

2.1 造模后3 h末端回肠组织病理观察 假手术组大部分肠绒毛尚完整，少数上皮细胞变性。黏膜下层、肌层轻度充血、水肿，浆膜偶见少量炎细胞浸润。模型组肠黏膜绒毛上皮细胞严重脱落，毛细血管充血明显，肌层和浆膜层可见中性粒细胞浸润，大部分腺体被破坏，肠壁水肿。见图1。

2.2 造模后3 h模型组FITC标记的大肠杆菌突破肠壁 在荧光显微镜下，FITC标记的大肠杆菌依次通过黏膜层、黏膜下层、肌层、浆膜层完成细菌移位，由于细菌移位是一个动态的过程，我们抓拍到个别细菌通过受损的肠壁移位。荧光显微镜下观察结果见图2。

图1 造模后3 h末端回肠HE染色（×400）

图2 造模后3 h模型组FITC标记的大肠杆菌突破肠壁过程

2.2 FITC荧光检测 模型组3 h后，腹水出现较高荧光值。胰腺、肠系膜淋巴结分别在4 h和6 h能检测出FITC荧光升高，且与假手术组有显著差异；门静脉血中各个时间段检测出FITC荧光与假手术组未见明显差异。腹水中荧光强度:模型组单位体积腹水中FITC荧光度随时间延长而增加,模型组3 h、4 h、6 h、8 h与2 h荧光度比较明显升高有统计学意义。与假手术组相比模型组腹水荧光强度在造模后3 h、4 h、6 h和8 h明显升高有统计学意义。见表1。模型组单位体积胰腺FITC荧光度随时间延长而增加，模型组4 h、6 h、8 h与2 h、3 h荧光度比较明显升高有统计学意义。与假手术组相比，模型组胰腺荧光强度在造模后4 h、6 h和8 h明显升高有统计学意义（见表2）。模型组单位体积肠系膜淋巴结FITC荧光度随时间延长而增加，模型组6 h、8 h与2 h、3 h、4 h荧光度比较明显升高有统计学意义。与假手术组相比，模型组肠系膜淋巴结荧光强度在造模后6 h和8 h明显升高有统计学意义（见表3）。模型组单位体积门静脉血中FITC荧光度随时间增加无 变化。各组之间亦无统计学意义，见表4。

表1 2组大鼠各时间点腹水FITC荧光强度检测（±s，rlu/m L）

表1 2组大鼠各时间点腹水FITC荧光强度检测（±s，rlu/m L）

注：与假手术组比较，a P＜0.05；与模型组中2 h相比，b P＜0.05

分组假手术组模型组n 20 30 2 h 0.191±0.042 0.235±0.103 3 h 0.231±0.045 1.616±0.332a、b4 h 0.351±0.032 2.353±0.323a、b6 h 0.532±0.034 2.982±0.330a、b8 h 0.797±0.049 3.171±0.300a、b

表2 2组大鼠各时间点胰腺荧光强度检测（±s，rlu/m L）

表2 2组大鼠各时间点胰腺荧光强度检测（±s，rlu/m L）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组中2、3 h相比，bP＜0.05

分组假手术组模型组n 20 30 2 h 0.206±0.039 0.34±0.059 3 h 0.299±0.068 0.371±0.180 4 h 0.345±0.061 0.849±0.103a、b6 h 0.430±0.058 1.310±0.240a、b8 h 0.682±0.122 1.727±0.195a、b

表3 2组大鼠各时间点肠系膜淋巴结荧光强度检测（±s，rlu/m L）

表3 2组大鼠各时间点肠系膜淋巴结荧光强度检测（±s，rlu/m L）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组中2、3、4 h相比，bP＜0.05

分组假手术组模型组n 20 30 2 h 0.210±0.041 0.272±0.055 3 h 0.303±0.070 0.325±0.046 4 h 0.287±0.060 0.360±0.085 6 h 0.357±0.086 0.609±0.058a、b 8 h 0.447±0.069 0.894±0.133a、b

表4 2组大鼠各时间点门静脉血荧光强度检测（±s，rlu/m L）

表4 2组大鼠各时间点门静脉血荧光强度检测（±s，rlu/m L）

分组假手术组模型组n 20 30 2 h 0.023±0.004 0.022±0.004 3 h 0.019±0.004 0.025±0.004 4 h 0.019±0.005 0.027±0.005 6 h 0.018±0.006 0.029±0.003 8 h 0.027±0.006 0.028±0.006

3 讨论

肠道是人体的“细菌总库”，一个健康成人的胃肠道细菌大约有1014个，包括需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌[7]，这么多的细菌并不引起机体致病，这一切归功于肠道正常的屏障功能。肠黏膜屏障包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障，肠黏膜屏障功能损害被认为是引起肠道细菌移位的重要机制[8]。新近研究发现，大鼠肠道缺血早期，即可出现肠黏膜上皮细胞紧密连接处的丝状肌动蛋白丢失，引起黏膜通透性增加。肠黏膜对缺血及缺氧非常敏感，SAP患者肠道血流灌注降低，肠黏膜缺血、缺氧，导致肠黏膜上皮的损伤，肠通透性增加[9]。

SAP时,肠道黏膜屏障机能减退,导致肠内常居细菌及其产物(内毒素)进入全身远隔脏器的过程叫细菌移位[10]。Adams等[11]从肠道细菌移位途径的角度探讨肠道细菌移位和内毒素血症的机制，发现在休克、创伤等情况下，肠道细菌可能首先通过肠道淋巴通道移位入血，经肺循环影响肺，进而经体循环影响全身脏器，即肠系膜淋巴结-胸导管-体循环轴途径。亦有研究发现实验诱发的动物急性胰腺炎模型存在小肠黏膜改变，可继发胰腺、肠系膜淋巴结、脾脏、肝脏、骨髓细菌移位，并促进胰腺坏死[12]。

本实验中，假手术组在造模后早期，在腹水、胰腺、淋巴结可以发现少量细菌移位，考虑手术创伤所造成，因为此时肠屏障并没有出现严重破坏。模型组在造模后各个时间点均发现大量血性腹水，3 h后就能在腹水标本检测出较高强度的荧光强度，且与假手术组相比有统计学意义（P＜0.05），此时已有大量的细菌移入腹腔。说明模型组在3 h前就已经发生肠道绒毛结构改变和肠道通透性增加，直至肠上皮的紧密连接遭到破坏时，细菌就能穿透肠壁到达腹腔。模型组在造模4 h后胰腺组织发现细菌移位，考虑贴近胰腺附近的结肠腔内细菌直接穿透肠壁感染胰腺，胰腺与毗邻的结肠段位置很贴近，从解剖学上亦可以支持此推论。另外，少量的位置靠近十二指肠段肠道细菌，通过胰胆管逆行感染至胰腺也是一种感染途径。在SAP早期，机体处于严重的应激状态，肠道缺血缺氧及由此引发的缺血-再灌注损伤，氧自由基和各种炎症因子反应等一系列损害因素，导致肠黏膜上皮破坏，且早期全身和肠道免疫系统成抑制状态，清除细菌能力下降，移位的细菌就易于突破肠系膜淋巴结限制发生。本实验模型组，在造模后6 h开始大量转移至肠系膜淋巴结。门静脉血中至造模后8 h仍未发现有细菌移位，与Adams等提出的肠道细菌可能首先通过肠道淋巴回流，再通过淋巴通道移位入血的推论相符。综上所述，腹水和淋巴道可能是细菌重要的侵袭途径，且发生时间较早，血源性移位发生较晚。本实验观察FITC标记的大肠杆菌直接穿透肠壁，进一步形象的描述了早期细菌移位的发生途径，通过病理荧光照片的结果表现了细菌突破肠屏障的过程，提供了直接的依据。

国内学者研究认为，在SAP早期由于细胞因子和炎症介质的活化和释放未达到高峰，各种致病因素还处于蓄积过程，所以此时是救治的黄金时段[13]。本实验亦发现，在SAP早期，细菌尚未通过血液途径移位，远端脏器的感染未出现。所以早期最大限度地保护肠屏障，减少细菌移位，可以极大地影响SAP的结局。

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（收稿：2014-09-02 修回：2014-12-28）

（责任编辑 王 丰）

Bacterial Translocation in Early Severe Acute Pancreatitis Rats

WEIWei,CUINai-qiang,LIU Hong-bin,et al. The Second People's Hospital of Tianjin,Tianjin（300192）,China

Objective To study the time and route of bacterial translocation when FITC-labeled E.coli went through the intestinal barriers of rats with Severe Acute Pancreatitis(SAP).MethodsFifty healthymale wistar rats with weight of（250±30）g were randomly divided into a SAP group(n=30)and a sham-operated group(n=20).FITC-labeled E.coliwere given by gavage 3 hours before surgery.The rats were killed at 2 h,3 h, 4 h,6 h and 8 h after SAP was induced.Their pancreas and mesenteric lymph nodes were removed.The route and time of bacterial translocation were examined.ResultsCompared to the sham-operated group,a higher fluorescence intensity(P＜0.05)in ascitic fluid at 3 h,in pancreas at 4 h,and in mesenteric lymph nodes at 6 h in SAP group was detected.The fluorescence intensity in ascitic fluid was the highest.But bacterial translocation in the portal vein blood 8 hours after SAP was did not detected.ConclusionSAP can lead to impairment of intestinal barrier.Ascites and lymphatic system may be the important channels for bacterial translocation in early SAP.

Severe acute pancreatitis;early stage;bacterial translocation;rats

R657.5+1

A

1007-6948(2015)01-0042-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.01.013

1.天津市第二人民医院ICU（天津 300192）

2.天津市南开医院胆胰外科中心（天津 300100）

3.天津市急腹症研究所（天津 300100）

崔乃强，E-mail：nctsui@126.com