黄芪多糖组分-A1对豚鼠自身免疫性脑脊髓炎的抑制作用

郭喜霞贾梅1齐恒田2尹雅玲3潘国聘4赵繁荣4李鹏4

(新乡医学院第一附属医院，河南新乡453003)

摘要〔〕目的探讨黄芪多糖组分-A1(APS-A1)是对自身免疫性脑脊髓炎的抑制作用。方法用2.5、5、10 mg/kg 的APS-A1对自身免疫性脑脊髓炎豚鼠模型灌胃28 d。检测神经功能评分，血清含量，血浆白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-6、IL-10的含量及血浆神经肽Y(NPY)、阿片受体β-内啡肽(β-EP)的含量，并对神经元进行形态学观察。结果APS-A1剂量依赖性地抑制自身免疫性脑脊髓炎豚鼠神经功能评分下降、生化指标、神经递质及形态学等各项指标的变化(P<0.05)。结论APS-A1具有抑制自身免疫性脑脊髓炎的作用。

关键词〔〕黄芪多糖；自身免疫；脑脊髓炎

中图分类号〔〕R733.7〔

基金项目：河南省科技厅科技攻关项目(132102310247)

通讯作者：李鹏(1980-)，男，副教授，硕士，主要从事天然药物活性成分研究。

1濮阳市卫生学校2新乡医学院第三附属医院

3新乡医学院基础医学院4新乡医学院药学院

第一作者：郭喜霞(1982-)，女，住院医师，硕士，主要从事儿科学研究。

1材料与方法

1.1实验动物英国种短毛豚鼠，雄性，清洁级，4周龄，体质量(200±20)g(河南省实验动物中心提供，许可证号为SYXK-豫-005-0012)。动物房温度控制范围为18℃～22℃，环境洁净度为500 000～8 000级，相对湿度控制范围为40%～50%，换气次数控制范围为20次/h，气流速度控制范围为0.15～0.2 m/s，多级定向控制空气压差控制范围为10～15%，自动定时器控制光照周期(7：30～19：00为光照期，19：00～07：30为黑暗期)，常规豚鼠饲料(河南省实验动物中心提供，许可证号为SYXK-豫-005-0012)及二次净化水饲养。

1.2药品APS-A1(实验室自备分离、纯化)；醋酸泼尼松(武汉述元科技发展有限公司)。

1.3仪器及试剂Synergy H4全功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)； FACScan 型流式细胞仪(美国 Becton-Dickinson公司)；IL-1、IL-2、IL-6、IL-10 ELISA 试剂盒(美国R-D公司)；神经肽Y(NPY) 放射免疫试剂盒(天津杰瑞公司)；阿片受体β-内啡肽(β-EP)放射免疫试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；转化生长因子(TGF)-β、基质金属蛋白酶(MMP)-2、一氧化氮合酶(NOS)、CD3免疫组化试剂盒(长沙力康生物有限公司)。

1.4方法

1.4.1EAE豚鼠模型制备豚鼠氯胺酮麻醉(5 ml/kg，腹腔注射)，在无菌操作下，打开腹腔、胸腔，剪断两侧肋骨，用钝头针从心尖略偏左进针至主动脉，生理盐水灌注600 ml，4%多聚甲醛灌注固定。头部沿枕骨大孔处剪断，剥取脑和脊髓，去掉脊膜与马尾，称重，按照1∶3的质量比加入生理盐水并制备成25%的豚鼠全脊髓匀浆。豚鼠全脊髓匀浆和完全弗氏佐剂以2∶1 比例充分乳化制备成稳定的豚鼠全脊髓匀浆抗原乳剂待用。豚鼠氯胺酮麻醉(5 ml/kg，腹腔注射)，将豚鼠全脊髓匀浆抗原乳(1 ml/kg)皮下注入豚鼠两个后足垫皮内，同时左后肢足背皮下注射百日咳原浆液(2 ml/kg)，诱导 EAE 模型。免疫后每笼6只常规饲养。

1.4.2分组及处理豚鼠随机分5组，6只/组。①正常对照组：后足垫皮内注射等量生理盐水(1 ml/kg)；②EAE模型组：按照本实验操作规定，注射豚鼠全脊髓匀浆抗原乳剂(1 ml/kg)；③ 醋酸泼尼松组：注射豚鼠全脊髓匀浆抗原乳剂(1 ml/kg)后当日灌胃醋酸泼尼松(2 ml·kg-1·d-1)；④ APS-A1低浓度组：注射豚鼠全脊髓匀浆抗原乳剂(1 ml/kg)后当日灌胃APS-A1(2.5 ml·kg-1·d-1)；⑤ APS-A1中浓度组：注射豚鼠全脊髓匀浆抗原乳剂(1 ml/kg)后当日灌胃APS-A1(5 ml·kg-1·d-1)；⑥ APS-A1高浓度组：注射豚鼠全脊髓匀浆抗原乳剂(1 ml/kg)后当日灌胃APS-A1(10 ml·kg-1·d-1)。第28天乙醚麻醉，指标检测。

1.4.3EAE神经功能评分从建模当天起观察每日发病情况，测体重1次/d，记录发病潜伏期、症状持续时间、发病率及病死率，并进行神经功能评分。EAE神经功能评分：0分：无明显异常；1分：尾部张力障碍；2分：后肢中度无力或麻痹；3分：后肢瘫痪，尿便失禁；4分：部分或完全前肢瘫痪；5分：濒死或死亡。每天进行3次神经功能评分，取均值作为每只豚鼠每天的神经功能评分。

1.4.5酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-1、IL-2、IL-6、IL-10按照ELISA试剂盒操作，450 nm单波长下，酶标仪读取标准管及测试管OD值。

1.4.6放射免疫法检测血浆NPY、β-EP的含量按照放射免疫试剂盒说明书要求操作，4℃冰箱过夜24 h，加入分离剂并充分混匀，室温放置20 min，4℃恒温3 000 r/min 离心20 min，弃去上清液。在γ计数仪上检测血清NPY、β-EP的含量。

1.4.7免疫组化检测脑组织TGF-β、MMP-2、NOS、CD3的含量按照免疫组化试剂盒说明书要求操作。200倍光镜下，每张切片随机选取5个视野，每个视野计数50个细胞，计数胞质呈棕黄色的阳性细胞。

1.4.8光镜下观察神经元形态豚鼠免疫后第28天乙醚麻醉，取出豚鼠脑，多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片(3～4 μm)，HE染色，光学显微镜下观察。

1.4.9电镜下观察神经元形态豚鼠免疫后第28天乙醚麻醉，取出豚鼠脑3～4块，每块1 mm大小，制作电镜切片，透射电镜下观察。

1.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析及SNK-q多重比较分析。

2结果

2.1EAE豚鼠神经功能评分EAE组豚鼠神经功能评分最高为2.5分，豚鼠相继出现进食减少、蜷缩少动、精神萎靡、皮毛干枯、大小便失禁、四肢无力及进行性全身瘫痪，部分豚鼠死亡；醋酸泼尼松组神经功能评分最高为0.45分，与同日EAE模型组比较有明显差异(P<0.05)； APS-A1高浓度组神经功能评分最高为0.50分，与同日EAE模型组比较有明显差异(P<0.05)。见图1。

2.3血浆IL-1、IL-2、IL-6、IL-10的含量EAE模型组外周血IL-1、IL-2、IL-6、IL-10含量明显升高；与EAE模型组比较，醋酸泼尼松与APS-A1高浓度组的IL-1、IL-2、IL-6、IL-10均有明显差异(P<0.05)。见表2。

2.4血浆神经递质NPY、β-EP的含量EAE模型组外周血神经递质NPY、β-EP的含量明显升高；醋酸泼尼松组与APS-A1高浓度组明显抑制EAE豚鼠NPY、β-EP升高，与EAE模型组比较有明显差异(P<0.05)。见表2。

组别CD+4细胞数CD+8细胞数CD+4/CD+8正常对照组43.65±1.682)3)25.76±1.562)3)1.66±0.272)3)EAE模型组53.76±2.651)18.65±0.871)2.86±0.361)醋酸泼尼松组45.54±1.561)2)3)24.64±2.061)2)3)1.97±0.231)2)3)APS-A1低浓度组51.44±2.041)3)18.64±2.141)3)2.86±0.291)3)APS-A1中浓度组44.46±2.111)2)23.33±1.751)2)2.44±0.261)2)APS-A1高浓度组46.94±1.441)2)3)25.89±1.682)3)1.95±0.361)2)3)

与正常对照组比较：1)P<0.05；与EAE模型组比较：2)P<0.05；与APS-A1中浓度组比较：3)P<0.05，下表同

2.5脑组织TGF-β、MMP-2、NOS、CD3 含量EAE模型组豚鼠脑组织TGF-β降低、MMP-2升高、NOS升高、CD3升高；醋酸泼尼松组与PAS-A1高浓度组明显抑制豚鼠脑组织TGF-β降低、MMP-2升高、NOS升高、CD3升高，与EAE模型组比较有明显差异(P<0.05)。见表3。

组别IL-1IL-2IL-6IL-10NPYβ-EP正常对照组1.78±0.352)3)6.65±1.062)3)3.76±0.352)3)633.76±32.652)3)398.34±21.732)3)316.78±23.842)3)EAE模型组4.97±0.671)3)12.76±1.671)3)7.84±1.071)3)1229.54±98.661)3)585.65±56.741)3)178.98±16.491)3)醋酸泼尼松组7.77±0.981)2)3)9.56±1.031)2)3)4.57±0.881)2)3)1045.77±87.761)2)3)417.69±23.681)2)3)329.15±30.221)2)3)APS-A1低浓度组5.98±0.641)3)9.36±0.851)3)7.87±0.651)3)1165.33±65.651)3)521.27±35.991)3)198.45±21.971)3)APS-A1中浓度组5.78±0.431)2)9.76±1.361)2)5.65±0.641)2)1176.69±89.951)2)497.89±29.681)245.58±32.721)APS-A1高浓度组8.76±0.841)2)3)11.55±1.271)2)3)4.84±0.961)2)3)1246.98±112.051)2)3)422.16±32.781)2)3)347.24±33.261)2)3)

组别TGF-βMMP-2NOSCD3正常对照组20.65±3.332)3)6.76±1.472)3)13.65±1.232)3)12.60±1.292)3)EAE模型组12.67±0.691)3)32.73±2.731)3)36.63±4.051)3)36.56±5.451)3)醋酸泼尼松组17.87±0.831)2)3)7.17±1.471)2)3)16.55±2.551)2)3)12.37±1.751)2)3)APS-A1低浓度组14.65±0.641)3)25.77±4.721)3)32.83±4.661)3)32.35±3.981)3)APS-A1中浓度组15.58±0.491)15.54±3.901)22.40±3.651)25.64±2.671)APS-A1高浓度组17.56±0.641)2)3)10.53±1.971)2)3)16.96±1.961)2)3)14.96±1.761)2)3)

图1　各实验组EAE神经功能评分

2.6光镜下神经元形态EAE豚鼠大脑皮层神经元肿胀，并有炎细胞浸润，部分神经元胞体变小或呈三角形，基质疏松伴明显微空泡形成；醋酸泼尼松组和高浓度的APS-A1组明显抑制神经元凋亡现象。见图2。

A.正常对照组；B.EAE模型组；C.醋酸泼尼松组；D.APS-A1低浓度组；E.APS-A1中浓度组；F.APS-A1高浓度组 图2　豚鼠大脑神经元光镜图像(HE，400×)

2.7电镜下神经元形态EAE豚鼠大脑皮层神经元皱缩、膜结构不清；胞核固缩，染色质聚集成团、异染色质增多，高尔基体增多，线粒体肿胀，嵴融合并出现空泡变性。醋酸泼尼松和高浓度的APS-A1组明显抑制神经元凋亡现象。见图3。

A.正常对照组；B.EAE模型组；C.醋酸泼尼松组；D.APS-A1低浓度组；E.APS-A1中浓度组；F.APS-A1高浓度组 图3　豚鼠大脑神经元电镜图像(8 000×)

3讨论

EAE在儿童中的发病几率较高，目前，糖皮质激素是治疗EAE的常用药物，具有抑制免疫应答、抗炎、抗毒、抗休克作用〔5〕。本研究结果显示，APS-A1(10 g·kg-1·d-1)能够推迟EAE发病时间，抑制EAE豚鼠神经功能下降，与醋酸泼尼松(2 g·kg-1·d-1)效果接近。

TGF-β对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。活化的人MMP-2直接攻击血管基底膜，引起炎细胞浸润。NOS参与调节NO生成，NO是先天性免疫应答的调节性效应分子，作为一种信息传递物质维持正常的生理功能。CD3仅存在于T细胞表面，参与T细胞的信号转导。本结果显示，APS-A1(10 g·kg-1·d-1)抑制EAE豚鼠TGF-β、MMP-2、NOS、CD3的变化。APS-A1的作用与醋酸泼尼松类似，治疗EAE前景较好，其具体的作用机制有待进一步研究。

4参考文献

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〔2012-12-20修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)