分化型甲状腺癌组织中HSP70与TNF-α的表达及与临床病理的相关性

王新征刘金彪侯永强王宁王明军

(河南科技大学第一附属医院普外三科,河南洛阳471000)

摘要〔〕目的探讨分化型甲状腺癌组织中热休克蛋白70(HSP70)与肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达及与临床病理的相关性。方法收集该院2012年6月至2014年3月甲状腺癌切除标本(石蜡包埋)40例，取40例甲状腺良性病变及40例正常甲状腺组织，应用PCR技术检测组织中HSP70与TNF-α的表达，分析甲状腺癌组织中HSP70与TNF-α的表达及其与临床病理的相关性。结果癌组织中HSP70与TNF-α的表达量明显高于正常组织、良性病变组织(P<0.05)，两两比较显示HSP70和TNF-α的表达在正常组织与癌组织及良性病变组织与癌组织之间的差异具有统计学意义(P<0.05)，正常组织与良性病变组织之间的差异无统计学意义(P>0.05)；癌组织中HSP70和TNF-α的表达与临床病理特征行Spearman秩和检验，结果显示HSP70的表达与肿瘤大小、颈淋巴结转移以及分化程度之间无相关关系(P>0.05)，HSP70的表达与临床病理分期之间呈正相关(P<0.05)。TNF-α的表达与颈淋巴结转移、临床病理分期之间呈正相关(P<0.05)，与分化程度之间呈负相关(P<0.05)，与肿瘤的大小之间无关性(P>0.05)。结论HSP70与TNF-α在甲状腺癌组织中高表达，HSP70与TNF-α的表达与临床的病理分期之间呈正相关关系，说明二者在甲状腺癌中发挥着重要的作用。

关键词〔〕甲状腺癌；HSP70；TNF-α

中图分类号〔〕R736〔

第一作者：王新征(1977-)，男，硕士，主治医师，主要从事外科学研究。

甲状腺癌约占全身恶性肿瘤的1.3%～1.5%，且有增长趋势〔1〕。其中乳头状癌较早出现颈淋巴结转移，但预后较好；滤泡状腺癌肿瘤生长较快，属中度恶性，易经血运转移；未分化癌预后很差，平均存活时间3～6个月〔1，2〕。热休克蛋白70(HSP70)与肿瘤坏死因子(TNF)-α在肿瘤中的作用已经得到证实，但是在甲状腺癌中的作用还不很明确〔3〕，本文研究HSP70与TNF-α的表达及与病理特征的关系。

1资料与方法

1.1一般资料收集我院2012年6月至2014年3月甲状腺癌切除标本(石蜡包埋)40例。纳入标准：①经过病理组织检查确诊，并且能收集完整的检查和治疗资料。②不患有其他重要的并发症，或内分泌性疾病，甲状腺患者在手术前均未放化疗或者免疫治疗。③符合伦理道德，家属或患者签署了知情同意书。排除标准：①患者本身患有其他重要的器官衰竭性疾病或内分泌性疾病。②患者在手术前有过放化疗或者免疫治疗。③不能收集到完整的治疗和检查资料。男24例，女16例，年龄60～85〔平均(72.35±7.44)〕岁，体重(42.33±3.08)kg，病理类型：乳头状癌24例、滤泡状癌8例、未分化癌4例、其他4例；按照甲状腺癌TNM分期(AJCC2002)Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅳ～Ⅲ期15例。同期再选取40例甲状腺良性病变〔男26例，女14例，年龄(72.83±7.73)岁，体重(44.31±2.55)kg〕以及40例正常甲状腺(良性病变2 cm以外)组织，男26例，女14例，年龄60～86〔平均(72.83±7.73)〕岁，体重(44.35±2.25)kg。三组的一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2试剂RNA提取试剂盒以及DNAmarker购自上海捷瑞生物工程有限公司，75%乙醇(0.1% DEPC配制)；PCR试剂盒购自康泰生物科技有限公司；兔抗人 HSP70、TNF-α多克隆抗体 购自上海信然生物有限公司。

1.3研究方法RNA提取以及PCR反应：所有的操作都按照RNA试剂盒和PCR试剂盒的操作说明严格进行。RNA 提取方法(TRIzol法)：试剂准备：①TRIzol试剂、氯仿、75%乙醇(0.1% DEPC配制)，②塑料器皿需用0.1% DEPC水浸泡，③0.1%DEPC水：100 ml ddH2O中加入DEPC 0.1 ml，充分振荡，37℃孵育12 h以上，121℃高压灭菌20 min，于4℃保存。操作步骤：50～100 mg组织中加入1 ml TRIzol试剂；样品常温静置5 min；加入0.2 ml(1 ml TRIzol试剂)氯仿，充分振荡15 s并于15℃～30℃静置2～3 min；于2℃～8℃ 12 000 r/min离心15 min，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA；取上清，加入0.5 ml异丙醇混匀，于15℃～30℃静置10 min后，管底有胶状沉淀，即为RNA；于2℃～8℃ 12 000 r/min离心10 min后弃去上清；加入1 ml 乙醇(75%)混匀；于2℃～8℃ 7 500 r/min离心5 min后弃上清；将RNA样品凉干加入适量DEPC水溶解。PCR反应条件：94℃变性5 min，循环次数35个。循环参数为：94℃变性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸30 s，最后 72℃延伸15 min。RNA定量：RNA(mg/ml)=40×OD260×稀释倍数(n)/1000，RNA纯品OD260/OD280=2.0。

2结果

2.1不同组织中HSP70与TNF-α的表达水平比较癌组织中HSP70与TNF-α的表达量明显高于正常组织、良性病变组织(P<0.05)，正常组织与良性病变组织之间的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

组别HSP70mRNATNF-αmRNA正常组织1.23±0.061.15±0.21良性病变组织1.34±0.071.22±0.30癌组织11.23±2.255.45±1.24F/P值18.057/0.00011.720/0.000

2.2甲状腺癌组织中HSP70与TNF-α表达水平与临床病理的相关性HSP70的表达与肿瘤大小、颈淋巴结转移以及分化程度无相关关系(P>0.05)，与临床病理分期呈正相关(P<0.05)。TNF-α的表达与颈淋巴结转移、临床病理分期呈正相关(P<0.05)，与分化程度呈负相关(P<0.05)，与肿瘤的大小无相关性(P>0.05)。见表2。

临床病理特征nHSP70/GAPDHrs/P值TNF-α/GDPDHrs/P值肿瘤大小(cm)<1911.41±1.270.324/0.0675.44±1.300.226/0.0781～52612.35±1.265.43±1.38>5514.23±1.336.14±1.32颈淋巴结转移是189.11±1.250.032/0.5696.56±1.300.455/0.025否229.97±2.235.58±1.28分化程度1级118.69±1.300.231/0.0896.47±1.24-0.566/0.0142级218.77±1.265.34±1.233级88.89±1.233.78±1.22病理分期Ⅰ～Ⅱ258.31±2.330.872/0.0003.45±0.120.856/0.000Ⅳ～Ⅲ1514.51±2.446.51±0.11

3讨论

甲状腺恶性肿瘤中最常见的是甲状腺癌，极少数可有恶性淋巴瘤及转移瘤，甲状腺癌占全身恶性肿瘤的1%。除髓样癌外，绝大部分甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞。甲状腺癌的发病率与地区、种族、性别有一定关系。美国的甲状腺癌发病率较高，据统计，1973～2002年，美国甲状腺癌的年发生率约增加了2.4倍，而且这种趋势仍然在逐年增长〔4〕。国内的甲状腺癌发病率较低，据统计，其中男性约(0.8～0.9)/10万，女性约(2.0～2.2)/10万〔5〕。甲状腺癌大多处于低度恶化的状态，早期临床表现不明显，多无自觉症状，颈部肿块往往为非对称性硬块，肿块易较早产生压迫症状，如伴有声音嘶哑，呼吸不畅，吞咽困难或局部压痛等压迫症状，颈静脉受压时，可出现患侧静脉怒张与面部水肿等体征，特别在甲状腺肿大伴有单侧声带麻痹时，为甲状腺癌的特征之一〔5〕。HSP70是分子量约70 kD的HSP，是HSP家族中重要的一员，被称为主要HSP，包括分子量为68、72、73、75、78 kD等的20多种蛋白，在正常细胞中水平较低，应激状态下可明显升高，是HSP研究中最多的一种。尤其是对HSP70的结构、功能以及表达调控机制的研究较多，正常情况下HSP70位于胞质内，受到热休克刺激时，核内HSP70迅速增加，浆内只有少量存在，细胞处于恢复阶段时，核内的HSP70消失，浆内仍有低水平HSP70表达〔6〕。近年来研究发现HSP70在肿瘤的发生发展中起着重要的作用〔7〕。TNF-α为巨噬细胞产生，TNF在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞，或抑制增殖作用。肿瘤细胞株对TNF-α敏感性有很大的差异，TNF-α对极少数肿瘤细胞甚至有刺激作用。本研究结果与HSP70和TNF-α在其他的已经确认的结论是一致的〔8，9〕。

综上所述，HSP70与TNF-α在甲状腺癌组织中高表达，二者在甲状腺癌中发挥着重要的作用，在临床的诊断、治疗以及预防发挥着重要的作用。

4参考文献

1李延辉，夏明汗，康举龄，等.HSP70和P53 蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及其与临床病理特征的关系〔J〕.现代生物医学进展，2011；11(13)：2504-8.

2苏波，云鹏，张晓孙，等.HSP70与TNF-α在甲状腺癌组织中的表达及其与临床病理分期关系的研究〔J〕.南京医科大学学报(自然科学版)，2013；33(12)：1698-9.

3Grogan RH，Mitmaker EJ,Clark OH，etal.The evolution of biomarkers in thyroid cancer-from mass screening to a personalized biosignature〔J〕.Cancers (Basel)，2010；2(2)：885-912.

4Sokolowska I，Woods AG，Gawinowicz MA,etal.Identification of potential tumor differentiation factor (TDF) receptor from steroid-responsive and teroid-resistant breast cancer cells〔J〕.J Biol Chem，2012;287(3)：1719-33.

5Hu S，Claud EC，Musch MW,etal.Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon-γ and tumor necrosis factor-α〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2010;298(4)：481-92.

6Wang HQ，Zhang HY，Hao FJ，etal.Induction of BAG2 protein during proteasome inhibitor-induced apoptosisn thyroid carcinoma cells〔J〕.Br J Pharmacol，2008;155(5)：655-60.

7Dutta SK，Girotra M，Singla M，etal.Serum HSP70：a novel biomarker for early detection of pancreatic cancer〔J〕.Pancreas，2012;41(4)：530-4.

8Li LC，Jayarama S，Pilli T，etal.Down-modulation of expression，or dephosphorylation，of IG20/MADD in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-resistant thyroid cancer cells makes them susceptible to treatment with this ligand〔J〕.Thyroid,2013;23(1)：70-8.

9Lo SZ，Steer JH，Joyce DA.TNF-α renders macrophages resistant to a range of cancer chemotherapeutic agents through NF-κB-mediated antagonism of apoptosis signalling〔J〕.Cancer Lett，2011;307(1)：80-92.

〔2014-05-10修回〕

(编辑袁左鸣)