池雪林，曾显成，黄小红，罗树红，汪世华

(1.福建农林大学生命科学学院;2.福建农林大学动物科学学院中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室，福建福州350002;3.南方医科大学生物技术学院，广东广州)

羊口疮(orf)是由羊口疮病毒(orf virus，ORFV)感染引起的山羊、绵羊、多种野生动物和人类的一种急性接触性和高度嗜上皮性的动物传染病[1－3].本病主要侵犯羊的口唇、蹄和外阴、乳房等部位，临床上以形成丘疹、水疱、脓疱和疣状痂皮为特征的病变[4]，造成皮肤或黏膜的增生性损伤[5].羊口疮最早于1920年发现于欧洲，目前，该病在养羊的国家和地区普遍存在，发病率高，敏感羊群发病率接近90%，病毒能够长期潜伏于宿主皮肤内并造成持续感染和继发感染，因此，该病已严重制约世界养羊业的发展[6－11].研究ORFV的形态发生学以及病毒感染宿主细胞的超微病理学观察，有助于了解病毒感染的发生、发展及转归过程，也是进一步阐明病毒致病机理的基础数据，然而，国内外对羊口疮病毒感染OFTu细胞的病毒形态特征及感染细胞超微结构动态变化系统的研究报道较少[12].本研究以羊口疮福建分离株YX株感染OFTu细胞为模型，从细胞病变、病毒负染色及超薄切片透射电镜技术，系统地对ORFV的形态发生学和感染细胞的超微结构变化进行观察，为阐明羊口疮病毒感染细胞的生物学特性和致病机理提供依据.

1 材料与方法

1.1 病毒与细胞

ORFV-YX强毒株由本实验室2012年在福建省分离、鉴定[13].OFTu细胞由本实验室保存[13]，为ORFV的敏感增殖细胞株，用于ORFV的培养增殖及病毒效价测定.

1.2 细胞培养与病毒增殖

OFTu细胞培养单层后，接种ORFV-YX强毒，37℃吸附1 h，倒掉接种液，加入含有5%胎牛血清的MEM(Hyclone公司)，于37℃细胞培养箱中继续培养.每天观察细胞病变，当细胞病变达75%收病毒并在OFTu细胞中连续传代.按 Reed-Muench法进行 TCID50滴定，病毒效价为107.2TCID50·mL－1.

1.3 电镜负染观察

将ORFV培养液冻融3次，3000 r·min－1低速离心30 min除去细胞碎片，取上清，17000 r·min－1高速离心70 min浓缩病毒，将病毒悬液滴于铜网上，吸附4 min后，用2%磷钨酸(pH 6.8)负染，透射电镜观察.

1.4 病毒感染及样品的收集

OFTu细胞在含有10%胎牛血清的MEM培养基内进行传代培养，待细胞长到单层时，按每250 mL培养瓶接种0.3 mL病毒悬液(107.2TCID50·mL－1)，37℃吸附1 h，倒掉接种液，加入含有5%胎牛血清的MEM，于37℃细胞培养箱中继续培养，分别于接毒后6、12、18、24 h收样.

1.5 超薄切片制作和电镜观察

文献[14－16]制作超薄切片，将感染ORFV不同时间段细胞倒掉生长液，用细胞刮刮下细胞，将细胞悬液装入尖底EP管，以1500 r·min－1在室温离心10 min，使细胞培养物压积成团，倒去上清液，沉淀经固定、脱水、浸透和包埋，用Leica UC6切超薄切片，2%醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，JEM-2100透射电镜观察.

2 结果与分析

2.1 ORFV感染OFTu细胞的观察

OFTu细胞对ORFV-YX株较敏感，感染OFTu细胞在第1代就可见到明显的细胞病变(cytopathic effect，CPE)，但细胞病变发展较慢，从第3代开始，CPE趋于稳定，出现时间形成规律.感染24 h可见少数细胞收缩、变圆，开始出现病变，但大部分细胞保持完整(图1B);感染48 h细胞聚堆、变圆的细胞数量增多，可见少量死细胞，CPE达50%(图1C);感染72 h细胞出现圆缩、聚堆，病变细胞坏死、崩解、脱落，细胞单层出现大的空洞，培养液中悬浮大量脱落的细胞，CPE达80%以上(图1D);阴性对照细胞保持贴壁生长，细胞单层形态清晰、完整，呈梭形，未见CPE(图1A).

图1 ORFV-YX感染OFTu细胞显微镜观察Fig.1 Cytopathic effect(CPE)of the ORFV-YX virulent strain in primary ovine fetal turbinate(OFTu)cells

2.2 电镜负染观察

通过电镜观察可见病毒粒子外观呈圆形或卵圆形，有囊膜，直径约150－250 nm，具有痘病毒粒子的典型特征(图2A).高倍放大可清晰观察病毒粒子表面有绳索样结构缠绕，排列很规则，形似桑椹(图2B).

图2 ORFV-YX株电镜负染观察Fig.2 Transmission electron microscopy technique of negative staining of ORFV-YX virulent strain

2.3 病毒的形态发生及宿主细胞的超微结构变化

透射电镜下观察，ORFV多呈椭圆形、砖形或卵圆形，可观察到双层囊膜，圆形粒子直径280 nm，椭圆形的病毒粒子长约250 nm，宽约180 nm，一些病毒可见两面凹陷呈哑铃形的核酸芯髓和两个侧小体结构(图3G)，病毒粒子在细胞浆中呈聚集分布(图3H)或散在分布(图3G).

图3 ORFV-YX株感染OFTu细胞超微结构观察Fig.3 Ultrastructural changes observed in OFTu cells infected with ORFV-YX virulent strain

电镜观察显示，ORFV感染OFTu细胞后6 h，可见细胞内质网扩张明显，呈囊状，池内分离，线粒体增生、扩张，边界模糊，脊变暗或消失(图3A)，核糖体脱落，细胞胞浆内DNA病毒复制的数量稍有增多并且伴有小囊泡(图3B)，可见胞浆空泡增多、出芽，早期凋亡现象(图3C).感染12 h，细胞胞浆内电子密度加深，线粒体脊变暗，模糊不清(图3D)，内质网内可见未成熟病毒粒子(图3E)，考虑此阶段为病毒DNA早期复制阶段.感染18h，胞浆内可见大量成熟和未成熟典型的病毒颗粒，病毒粒子周围区域电子密度加深是病毒复制的工厂(图3F);高尔基体扩张，大量病毒粒子聚集在囊泡周围，该区域可见大量未成熟的病毒粒子靠近高尔基体形成囊膜，获得囊膜成熟的病毒粒子正在朝细胞膜方向移动，通过出芽方式释放病毒粒子(图3G);胞浆中可见大量成熟和未成熟的病毒粒子聚集，周围是絮状包涵体(图3H).感染24 h，宿主细胞被病毒破坏，细胞质破碎、分散、边聚，细胞核缩小、溶解，大部分细胞溶解、坏死，细胞器无法辨认，剩下一些空泡类的结构(图3I).

3 讨论与结论

羊口疮病毒属于痘病毒科(Poxviridae)脊索动物痘病毒亚科(Chordopoxrinae)的副痘病毒属(Parapoxvirus)，是在细胞浆内复制的有囊膜的双链DNA病毒[16－18].分离羊口疮病毒常用牛和羊的睾丸细胞，胎羊皮肤细胞、胎牛和胎羊的肾细胞，但睾丸细胞的获得受季节限制，且原代细胞存在细胞获取过程复杂及大量使用实验动物等问题[19－20].羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)具有细胞培养方便、长期继代培养稳定、分离ORFV细胞病变显著、ORFV效价高等优点[21]，常用于羊口疮病毒的培养和致病机制研究[22－23].结果显示，ORFV感染OFTu细胞在24 h即可观察到细胞病变，48 h病变明显，96 h细胞坏死，脱落出现空洞.超薄切片电镜观察显示，感染6和12 h没有观察到典型的病毒粒子，感染18 h在细胞浆中可观察到大量发育不同阶段的病毒粒子，感染24 h，观察到细胞凋亡、溶解.本试验选用OFTu细胞增殖羊口疮病毒，电镜观察病毒的形态、结构及分布取得了较好的效果，确定最佳观察时间是在24 h之内.

研究表明，ORFV感染细胞超微结构变化较大的细胞器有内质网、线粒体、高尔基体和细胞核.ORFV感染细胞6 h，内质网扩张呈囊，池内分离，这可能是羊口疮病毒复制机理与痘苗病毒类似，复制前期病毒靠近内质网脱衣壳和释放病毒DNA，形成的病毒复制复合物被粗面内质网膜所包围形成内质网囊，Mallardo et al[24]研究表明，这种结构变化可能有助于提高病毒复制的效率.病毒感染细胞后需要细胞参与合成一些病毒装配所需的蛋白，导致细胞能量需求增大，而线粒体是细胞能量供应的主要细胞器，所以感染早期线粒体增生，病毒复制区线粒体大量聚集，随着时间进程，线粒体嵴肿胀、脊变暗，模糊不清，最后呈现空泡化等超微结构变化，并诱导了细胞凋亡的发生.感染12 h，电镜观察到高尔基体出芽，感染18 h，观察到高尔基体扩张，靠近高尔基体区域有多个未形成囊膜的病毒粒子和有囊膜的成熟病毒粒子，这可能是感染中期病毒蛋白合成后需高尔基体将内质网合成的蛋白质进行加工和包装，在高尔基体进行膜转化形成病毒的囊膜，成熟的病毒粒子最后再分泌到胞外.感染24 h，细胞超微结构表现为细胞核溶解呈早期凋亡现象，胞浆出芽，整个细胞破碎、裂解、消失.本试验观察到ORFV的组装是在高尔基体囊泡周围进行的，组装完成的病毒粒子最后朝细胞膜方向移动，通过出芽方式释放病毒粒子.但也看到一些病毒粒子聚集在一起，通过细胞溶解的方式释放病毒粒子.本研究利用超薄切片及电镜技术在体外观察ORFV在OFTu细胞上的感染、复制和组装过程，有助于全面了解ORFV的感染过程、病毒感染引起的细胞变化以及病毒与宿主细胞之间的相互作用，对ORFV形态学诊断及致病机理研究具有重要意义.

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