*通讯作者:徐志广，副教授，Email:chzgxu@scnu.edu.cn.

血管紧张素I和II的N端三肽分子印迹预作用的理论研究

沈桂贤， 徐志广*， 章小慧

(华南师范大学化学与环境学院，广州 510006)

摘要：以血管紧张素I和II共同的N端三肽分子(AT)为模板分子，丙烯酸(AAc)为功能单体，采用DFT/B3LYP方法和6-31G(d, p)基组，模拟模板分子与功能单体分子印迹预作用体系的构型.通过研究AT与AAc在印迹比例不同时形成复合物的几何构型、电荷转移及结合能，对AT与AAc预作用的模式进行探讨.另外，进一步比较AT、BT和 CT (BT是血管紧张素I结构中C端的三肽分子，CT是血管紧张素II结构中C端的三肽分子)分别与AAc形成最大印迹比例复合物的作用模式及结合能.计算结果表明：AT与AAc通过氢键作用形成分子结构互补的复合物，当AT与AAc印迹比例为1∶6时，电荷转移最大，氢键数目最多，复合物的结合能最低(-361.78 kJ/mol)，氢键作用的位置显示精氨酸(Arginine, Arg)在印迹复合物中起重要作用；而BT和CT分别与AAc形成的复合物，最大印迹比例都为1∶5，结合能分别为-324.68、-284.66 kJ/mol.与BT和CT相比，AT更适合作分子印迹聚合物的模板分子.

关键词：血管紧张素; 丙烯酸； 分子印迹； 氢键； 理论研究

收稿日期：2014-07-03《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

基金项目：国家自然科学

中图分类号：O641文献标志码：A

Theoretical Research on Molecular Imprinted Polymer Pre-Action with the N-Terminal Tripeptide of Ang I and Ang II

Shen Guixian, Xu Zhiguang*, Zhang Xiaohui

(School of Chemistry and Environment, South China Normal University, Guangzhou 510006, China)

Abstract：Molecular imprinted interaction model was constructed with the common N-terminal tripeptide of Ang I and Ang II (AT), as template molecule, and acrylic acid(AAc) as functional monomer. Density functional theory(DFT) method at the B3LYP/6-31G(d, p) level was used to investigate the geometry optimization, the charge transfer and the binding energy of the complexes in various imprinted ratio with AT and AAc in order to discuss the acting models between AT and AAc. Furthermore, complexes in the maximum imprinted ratio with AT, BT, CT (BT is the C-terminal tripeptide of Ang I and CT is the C-terminal tripeptide of Ang II) and AAc compared the binding energy and the acting models for evaluation of molecular imprinted effect. Calculational results indicated that, AT and AAc formed complex via the hydrogen bonding interaction. The complex with a ratio of AT-AAc(1∶6) has the maximum charge transfer, hydrogen bonds number and binding energy (-361.78 kJ/mol). The position of hydrogen bonds from AT-AAc(1∶6) indicated the arginine(Arg) was the important section in the molecular imprinted interaction. The complexes with a ratio of BT-AAc (1∶5) and CT-AAc(1∶5) had the binding energy of -324.68 and -284.66 kJ/mol, respectively. This means among above three angiotensin bioactive peptide AT is the most suitable template molecule to the molecular imprinted polymers with AAc, theoretically.

Key words： Angiotensin; acrylic acid; molecular imprinting; hydrogen bond; theoretical research

血管紧张素II (Angiotensin II，Ang II)作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要生物活性肽，是由8个氨基酸脱水缩合形成的多肽(Asp-Arg-Val-Tyr-Lle-His-Pro-Phe)，它对心血管系统的正常发育、心血管功能稳态、电解质和体液平衡的维持，以及血压的调节均有重要作用.Ang II是由血管紧张素转换酶(ACE)催化水解血管紧张素I (Angiotensin I，Ang I)而来，若体内Ang II过度表达，会引起多种心血管疾病，如高血压和动脉硬化[1-2]，因此对Ang I和Ang II的选择性捕获以及高效分离准确测定，对患者的治疗具有重要意义.近年来发展的分子印迹技术可解决上述问题，分子印迹技术是源于高分子化学、生物化学和材料科学的交叉学科，是指功能单体与模板分子(印迹分子、目标分子)和交联剂在合适的溶剂中相互作用形成聚合物，通过一定的物理或化学方法脱去模板分子，获得具有特异选择性的分子印迹聚合物(molecular imprinted polymer, MIP)的制备过程，通常被形象地描述为识别分子钥匙的人工锁的技术[3-4].由于MIP具有极高的选择性、良好的稳定性、合成费用低和工业级规模制备等优点，所以近年来已广泛应用于传感器[5-10]、分离纯化[11-13]以及催化[14-15]等方面.但目前分子印迹的作用机理研究仍以实验层面为主要手段，少有以计算化学为手段来进行理论研究.因此，有研究者尝试将计算化学方法应用于分子印迹聚合物的合成研究中，不仅从分子水平上探讨分子印迹的识别机理，而且可快速筛选功能单体、优化模板分子与功能单体和交联剂的比例及确定合适的致孔剂.董文国等[16]采用密度泛函DFT方法用于合成茶碱分子印迹聚合物功能单体的选择,本研究组采用密度泛函DFT方法对一些印迹体系如金鸡纳碱分子印迹聚合物和阿昔洛韦分子印迹聚合物制备的模板分子与功能单体预作用进行理论研究，并结合实验成功地解释了上述印迹聚合物的分子识别机理[17-18].

最近，我们利用Ang I和Ang II 共同的N端三肽AT(Asp-Arg-Val)作为模板分子，丙烯酸(AAc)作为功能单体，构建了印迹Ang I和Ang II人工受体.麻醉大鼠实验证明，该受体能够中和大鼠体内过量的Ang II，具有潜在的控制高血压的作用[19].但实验部分不能完善地解释分子印迹的识别机理.因此，本文利用研究模板分子AT与功能单体AAc形成不同印迹比例复合物的几何构型、电荷转移及结合能，对AT与AAc预作用的模式及位点进行探讨.另外，进一步比较了AT、BT和CT(BT是Ang I结构中C端的三肽分子(Phe-His-Leu)，CT是Ang II结构中C端的三肽分子(His-Pro-Phe)分别与AAc形成最大印迹比例复合物的结合能及作用模式.

1计算方法

本研究组曾采用DFT/B3LYP方法研究含氢键的分子印迹体系，并能较好地解释其实验现象[17-18]，因而本文采用密度泛函理论(DFT)[20-22]中的B3LYP方法，在6-31G(d, p)基组下对模板分子AT、BT、CT(图1)、功能单体AAc及其复合物进行几何构型优化，在同样水平下进行频率计算，显示虚频数为0，表明优化构型稳定.利用(1)式对得到的稳定构型的结合能进行计算，对该结合能进行基组叠加误差(Basis Set Superposition Error (BSSE))校正.结合能用以下公式计算：

△EB=EC-ET-EF,

(1)

式中△EB为BSSE方法校正后的相互作用能，即结合能；EC为印迹复合物的总能量；ET为模板分子的能量；EF为AAc的能量.在本分子印迹体系中，模板分子与AAc的结合能以氢键作用能为主.以上所有的计算都是在Gaussian03程序[23]下完成的.

2结果与讨论

2.1几何构型

模板分子AT与功能单体AAc的优化几何构型及原子编号见图2.AT分子中的氮原子和氧原子可作为质子受体，而—NH2和—OH上的氢原子可作为质子给体；AAc分子中有1个羧基，羧基中的氧原子可作为质子受体，氢原子可作为质子给体.由此，AT中N2、O3、N5、O6、N8、O9、N10、O13、O14、N16、N18 和N20是主要的质子受体；H1、H4、H7、H11、H12、H15、H17、H19、H21和H22是主要的质子给体.AAc中O23和O24是主要的质子受体，H25是主要的质子给体.根据AT和AAc的质子受体和质子给体，构建氢键作用位点.当AT和AAc印迹比例为1∶1时，计算优化出共有6种不同的结合方式，二者形成的氢键作用位置标示见图1，每种不同的结合方式的结合能列于表1.

图1　 A T、 B T和 C T的分子结构

图2　 A T与 AAc的优化几何构型

Table1BindingenergiesofthecomplexesinthedifferentpositionofATandAAc(kJ/mol)(withBSSEcorrection)

kJ/ mol

从表1可见，当AT与AAc印迹比例为1∶1时，在AT分子中多个作用点进行计算，位置1的结合能是最大的.位置1形成O6…H25—O24与N20—H21…O23的双氢键结构，形成的氢键键长分别为0.169 6nm和0.188 5nm，均在强氢键范围内[24].说明在1∶1比例时， 丙烯酸优先在精氨酸Arg上结合.

在印迹体系进行计算机模拟时，AT与AAc的印迹比例分别采用1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶6共6种比例进行计算模拟研究.我们也尝试计算印迹比例为1∶7时的情况，由于分子间存在空间位阻，AT与AAc分子之间斥力增大，AAc与AAc分子之间相互影响，复合物的稳定性减弱.因此，经过几何优化，得到6个稳定印迹体系，几何构型见图3.每个稳定构型中AT与AAc通过分子间氢键作用，其氢键数目、键长与氢键作用位点列于表2中.

图3　 A T与 AAc形成不同印迹比例复合物的优化几何构型

Figure3OptimizedgeometriesofthecomplexesinvariousimprintedratiowithATandAAc

根据1∶1比例的结合能从大到小的顺序，分别优化得到1∶2到1∶6的印迹体系.当印迹比例为1∶2、1∶3、1∶4和1∶5时，两者之间分别形成4、6、8和10个氢键.当AT与AAc印迹比例为1∶6时，两者之间形成11个氢键，其氢键的作用位点分别为O6…H25—O24、N16—H17…O23、O13…H25—O24、N10—H12…O23、O9…H25—O24、N2—H1…O23、N20—H22…O23、N18—H19…O23、N16…H25—O24、N20—H21…O23、O3…H25—O24，氢键键长在0.15～0.23nm范围之内.随着印迹比例增大，AT与AAc之间形成的氢键数目和相互作用位点相应增加，其印迹体系越稳定，印迹效果越好.从作用位点的分布来看，1∶6的印迹体系中，精氨酸Arg上集中了3个功能单体AAc(图3)，说明该氨基酸在印迹体系中起重要作用.

表2AT与AAc预作用体系的几何参数

Table2Geometricalparametersofthepre-actionsystemwithATandAAc

AT∶AAcNumberofhydrogenbondActivepositionBondlength/nm1∶12O6…H25—O240.1696N20—H21…O230.18851∶24O6…H25—O240.1753N20—H21…O230.2055N16—H17…O230.2196O13…H25—O240.16141∶36O6…H25—O240.1757N20—H21…O230.1991N16—H17…O230.2353O13…H25—O240.1613O9…H25—O240.1669N2—H1…O230.19541∶48O6…H25—O240.1780N16—H17…O230.2070O13…H25—O240.1563N10—H12…O230.2239O9…H25—O240.1635N2—H1…O230.1957N20—H22…O230.2038N18—H19…O230.20811∶510O6…H25—O240.1773N16—H17…O230.1966O13…H25—O240.1570N10—H12…O230.2258O9…H25—O240.1636N2—H1…O230.1970N20—H22…O230.2079N18—H19…O230.2020N16…H25—O240.1917N20—H21…O230.18801∶611O6…H25—O240.1791N16—H17…O230.1952O13…H25—O240.1570N10—H12…O230.2250O9…H25—O240.1645N2—H1…O230.1956N20—H22…O230.2078N18—H19…O230.2022N16…H25—O240.1915N20—H21…O230.1881O3…H25—O240.1624

2.2电荷转移

氢键是由于与电负性较强的元素X相结合的氢原子，和另一分子中电负性较强的原子Y之间所产生的引力而形成的，用X—H…Y表示.由于X、H的电负性不同，X—H键具有强极性，X带部分负电荷，而H带部分正电荷，带部分正电荷的H就很容易与带有孤对电子的Y结合形成氢键.氢键的形成服从电学特性互补的特点，分子间因电性相异相吸，从而实现分子间结构上的互补.由此可见，氢键的形成引起复合物中成键原子间的电荷转移，为解释相互作用的本质，用自然布居分析NPA[25]电荷研究AT分子中原子之间及AT与AAc分子之间的电荷转移，从而讨论氢键的形成及强弱.

当AT与AAc印迹比例为1∶1时，在AT分子中，O6原子的负电荷由作用前的-0.614e增加到-0.700e，H21原子由作用前的电荷0.409e增加到0.451e，而整个AT分子的总电荷为0.009e，呈微弱正电性，AT与AAc分子间发生电荷转移，形成氢键.随着印迹比例的增加，AT分子中的质子受体和质子给体作用位点相应增多，AT与AAc分子间电荷转移的值相应增大.当AT与AAc印迹比例为1∶6时，在各作用位点中，AT分子中O3、O6、O9、O13和N16原子的负电荷由作用前的-0.658e、-0.614e、-0.635e、-0.637e和-0.658e增加到-0.701e、-0.687e、-0.725e、-0.743e和-0.718e.另一方面，H12、H17、H19、H21和H22原子由作用前的电荷0.382e、0.416e、0.374e、0.409e和0.410e增加到0.416e、0.472e、0.443e、0.450e和0.445e，AT分子的总电荷增至0.151e.与其它印迹比例的体系相比，当AT与AAc比例为1∶6时，AT分子中质子受体和质子给体作用位点达到最多，AT与AAc分子间电荷转移的值达到最大，形成的氢键作用最强.

2.3结合能

为比较上述印迹比例复合物中模板分子AT与功能单体AAc的结合能，我们采用B3LYP/6-31G(d,p)方法对其进行计算，并进行BSSE校正，数据列于表3.若复合物是稳定存在的，则结合能为负值，且其值越负，表明AT与AAc形成的复合物稳定性越强，印迹的理论效果越好[26].因此，用分子模拟计算AT、AAc及二者之间形成的复合物能量，比较其复合物结合能的大小，可以有效地筛选出识别效果更好的印迹比例.

从表3数据可知，印迹比例为1∶1时，结合能为-86.90kJ/mol，印迹比例为1∶2时为-152.02kJ/mol，比1∶1时的结合能降低了65.12kJ/mol，由此可知，AT与AAc形成的复合物稳定性显著增强.随着印迹比例的增加，其结合能△E越来越负.当印迹比例为1∶6时，此时结合能为-361.78 kJ/mol，复合物最稳定.说明分子印迹过程中AT与AAc的印迹比例为1∶6时，所得到的效果应该最好.

表3　复合物用B3LYP/6-31G(d,p)方法计算的结合能(BSSE校正)

2.4AT、BT和CT分别与AAc形成复合物的印迹比例

考察BT和CT的所有作用位点分别与AAc预作用(作用位置标示见图1)，优化计算得到最大的印迹比例都为1∶5(图4，作用位置与图1对应).AT、BT和CT分别与AAc形成最大印迹比例的复合物经BSSE校正后的结合能列于表4，从表4数据可知，AT-AAc复合物的结合能最低；相互作用的AAc数目最多，为6个；形成的氢键数目也最多，为11个.从几何结构也可看出AT分子易形成分子内氢键，呈一定刚性的Y型空间构型.从理论上证实，三者中AT更适合作分子印迹聚合物的模板分子.

图4BT和CT分别与AAc形成最大印迹比例复合物的优化几何构型

Figure 4Optimized geometries of the complexes in the maximum imprinted ratio with BT, CTand AAc, respectively

表4以B3LYP/6-31G(d,p)方法计算各复合物的结合能(BSSE校正)

Table 4Binding energies of the complexes calculated at the B3LYP/6-31G(d,p) level(with BSSE correction)kJ/molkJ/mol

ComplexNumberoffunctionalmonomerNumberofhydrogenbondBindingenergyBT-AAc58-284.66CT-AAc58-324.68

3结论

以AT为模板分子，AAc为功能单体，采用B3LYP/6-31G(d, p)方法对其不同印迹比例复合物进行计算.通过比较AT与AAc在印迹比例不同时形成复合物的几何构型、电荷转移和结合能，探讨了AT与AAc预作用的模式.结果表明，AT与AAc通过氢键作用形成分子结构互补的复合物，1∶6是AT与AAc形成的最大印迹比例，在这个比例下电荷转移最大，形成氢键数目最多，复合物的结合能最低(-361.78 kJ/mol).氢键作用的位置显示精氨酸Arg在印迹复合物中起重要作用.另外，比较了BT和 CT分别与AAc形成最大印迹比例复合物的作用模式及结合能.其二者复合物的最大理论印迹比例都为1∶5，结合能分别为-324.68和-284.66 kJ/mol，明显小于AT-AAc复合物的结合能，从理论上说明三者中AT更适合作分子印迹聚合物的模板分子.

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