尹璇,张昊,陈建平,马莉,张春江,杨晓萍△

1,25(OH)2D3对人肾小球系膜细胞增殖及PCNA表达的影响

尹璇1,张昊1,陈建平1,马莉1,张春江2,杨晓萍2△

目的探讨1,25-二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]对人肾小球系膜细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）表达及细胞增殖的影响。方法体外培养人肾小球系膜细胞，取传代培养至3～8代细胞随机分为4组：正常对照组（加含5%胎牛血清DMEM培养基），增殖对照组（EGF组，加10 μg/L的EGF），一般干预组[VD组，加10-8mol/L 1,25(OH)2D3]，增殖干预组[EGF+VD组，加10 μg/L EGF及10-8mol/L1,25(OH)2D3]，均作用48 h。流式细胞术检测各组细胞周期；Western blot检测各组PCNA表达的情况。结果（1）细胞周期。与正常对照组相比，EGF组G1期细胞明显减少，S、G2/M期细胞增多，增殖指数（PI）较高；VD组G1期细胞明显增多，S、G2/M期细胞减少，PI较低；与EGF组相比，VD组和EGF+VD组G1期细胞增多，S、G2/M期细胞减少，PI较低，差异均有统计学意义。（2）系膜细胞中PCNA蛋白的表达。与正常对照组相比，EGF组PCNA的表达较高，VD组PCNA的表达较低；与EGF组相比，VD组和EGF+VD组PCNA的表达较低。结论1,25(OH)2D3通过阻滞细胞周期、抑制PCNA的表达，从而抑制人肾小球系膜细胞的增殖。

肾小球系膜细胞；增殖细胞核抗原；表皮生长因子；细胞增殖；细胞周期；1,25-二羟基维生素D3

肾小球硬化是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）最常见的病理表现，其特征是肾小球系膜细胞（mesangial cells，MC）过度增殖和细胞外基质（ECM）的积聚。研究与肾小球系膜细胞增殖有关的因素，对肾小球损伤的逆转非常重要[1]。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一种在细胞周期的G1晚期和S期合成的蛋白质，在DNA合成与修复和细胞周期调控中被作为常用的增殖标志物，检测PCNA是研究细胞的增殖活性的既定方法[2]。肾小球系膜细胞增生的程度可以由免疫染色PCNA或巨噬细胞抗原（ED-1）进行评估[3]。1,25-二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]是维生素D3的生物活性形式，具有多种新型生物学效应，包括促使肿瘤细胞生长停滞，诱导细胞凋亡和分化。已有研究表明1,25(OH)2D3可显著抑制大鼠肾小球系膜细胞增殖[4]。本研究探讨1,25(OH)2D3对人肾小球系膜细胞增殖及PCNA表达的影响，为1,25(OH)2D3的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料（1）细胞株。人肾小球系膜细胞株(4200)购于湘雅医学院中心实验室。（2）试剂。低糖DMEM、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；青链霉素混合液、二甲基亚砜（DMEO，北京索莱宝生物科技有限公司）；磷酸盐缓冲液即PBS、1,25(OH)2D3、表皮生长因子（EGF）、碘化丙啶(美国Sigma公司)；小鼠抗人β-actin单克隆抗体、兔抗人PCNA单克隆抗体（Cell Signaling公司）；山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基复苏肾小球系膜细胞，取传代培养至3～8代细胞用于实验，采用完全随机法将其分为4组：正常对照组（加含5%胎牛血清DMEM培养基），增殖对照组（EGF组，加10 μg/L的EGF），一般干预组[VD组，加10-8mol/L的1,25(OH)2D3]，增殖干预组[EGF+VD组，加10 μg/L EGF以及10-8mol/L 1,25(OH)2D3]，均作用48 h。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期取对数期细胞，以2×105个/mL、2 mL/孔接种于6孔板内，按实验分组培养48 h，用胰蛋白酶消化细胞并收集，加入75%冰乙醇，吹打均匀，-20℃固定过夜，上机前再次离心，并用PBS洗涤1遍后，加500 μL PBS重悬细胞，加入RNA酶使其终浓度为10 g/L，30 min后加PI染色，终浓度变为50 mg/L，37℃避光保存，30 min后流式细胞仪检测细胞周期，计算增殖指数[PI=（S+G2M）/（G1+ S+G2M）]。实验重复3次。

1.2.3 Western blot检测人肾小球系膜细胞中PCNA的表达取对数期细胞，胰蛋白酶消化计数后，接种于一次性培养瓶，24 h后细胞贴壁，用无血清DMEM培养基培养24 h，同步化于G0期，按实验分组培养48 h，收集并裂解细胞，高速低温离心25 min，取上清煮沸5～10 min使蛋白变性，上样电泳，PVDF转膜，5%奶粉封闭，将PVDF膜置于一抗孵育（4℃过夜），TBST洗涤3×10 min，二抗孵育（室温1 h），TBST洗涤3×10 min，加ECL发光试剂，暗室曝光。

1.3 统计学方法应用SPSS 17.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，组间多重比较用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肾小球系膜细胞形态及生长情况的比较正常对照组胞体透亮，形态呈梭形，不规则星形、树枝状，密集处细胞重叠呈网状，胞浆、胞质较清楚；EGF组数目较多，形态与正常对照组相比无明显改变；VD组呈现一定程度的细胞凋亡，细胞体积缩小，胞核皱缩，数目较正常对照组减少，部分细胞漂浮；EGF+VD组细胞形态及生长情况与正常对照组大致相同，数目略有增加，见图1。

Fig.1Changes of mesangial cell morphology after 48-h drug intervention图1 药物干预48 h后系膜细胞形态的变化(×200)

2.2 1,25(OH)2D3对肾小球系膜细胞周期的影响与正常对照组相比，EGF组G1期细胞明显减少，S、G2/M期细胞增多，PI较高；VD组G1期细胞明显增多，S、G2/M期细胞减少，PI较低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；EGF+VD组细胞周期各时相分布与正常对照组差异无统计学意义。与EGF组相比，VD组和EGF+VD组G1期细胞增多，S、G2/M期细胞减少，PI较低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

2.3 肾小球系膜细胞中PCNA的表达情况正常对照组、EGF组、VD组和EGF+VD组PCNA/β-actin灰度值比值分别是1.09±0.15、1.62±0.20、0.69±0.14和1.14±0.24，差异有统计学意义（F=15.720，P＜0.05）。与正常对照组相比，EGF组PCNA的表达较高，VD组PCNA的表达较低，EGF+VD组与正常对照组差异无统计学意义；与EGF组相比，VD组和EGF+VD组PCNA的表达较低。与正常对照组比较，EGF组可见蛋白条带明显粗而深，VD组蛋白条带则变浅变细，EGF+VD组与正常对照组接近,见图2。

Tab.1The distribution of cell cycle detected by flow cytometry in four groups表1 4组细胞周期各时相分布比较（n=10，%，)

Tab.1The distribution of cell cycle detected by flow cytometry in four groups表1 4组细胞周期各时相分布比较（n=10，%，)

＊P＜0.05；a与正常对照组比较，b与EGF组比较，P＜0.05

组别正常对照组EGF组VD组EGF+VD组F细胞周期各时相分布G1期S期G2/M期74.38±1.63 64.71±1.70a80.89±1.47ab73.88±1.37b184.350＊19.75±1.27 26.73±1.48a14.54±1.11ab20.58±1.72b124.391＊5.08±1.87 7.44±2.26a4.42±2.00ab6.08±1.89b4.283＊PI 25.02±1.11 34.52±1.97a18.98±1.58ab26.48±2.12b135.424＊

Fig.2PCNA expression of mesangial cells detected by Western-blot assay in four groups图2 Western-blot检测各组系膜细胞中PCNA表达的情况

3 讨论

1,25(OH)2D3是维生素D3的生物活性形式，具有多种生物学效应。除了经典的钙、磷调节作用外，1,25(OH)2D3可通过诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期，导致细胞凋亡及生长停滞[5]。研究发现1,25(OH)2D3干预后，肾功能衰竭（肾衰）大鼠模型中系膜细胞减少，PCNA染色表达量也降低，提示PCNA可用来检测肾小球系膜细胞的增殖情况[6]。另有研究表明1, 25(OH)2D3在治疗大鼠肾炎模型的过程中可减少蛋白尿，炎性细胞浸润，抑制肾小球系膜细胞增殖，加速肾小球损伤修复等重要作用[7]。

PCNA作为反映细胞增殖最主要的标志物之一，PCNA mRNA的表达存在于细胞周期的所有阶段，在多种细胞中发现其具有调控细胞周期和DNA复制的功能[8-9]。本课题组前期研究1,25(OH)2D3对大鼠系膜增生性肾炎的作用发现，1,25(OH)2D3可从多方面抑制PCNA的表达，并抑制肾小球系膜细胞增殖，从而延缓肾小球疾病的进展[10]。本研究进一步探讨1,25(OH)2D3对人肾小球系膜细胞中PCNA表达的影响，结果显示，1,25(OH)2D3干预肾小球系膜细胞后，与正常对照组比较，光镜下细胞数目明显减少，呈现一定程度的细胞凋亡，细胞体积缩小，胞核皱缩；G1期细胞显著增多，S期、G2/M期细胞数量明显减少，提示1,25(OH)2D3可通过阻滞细胞周期，使细胞停滞在G1静止期，不转入S期、G2期进行DNA复制、有丝分裂，从而抑制细胞增殖；本研究中VD组PCNA表达量较正常对照组显著降低，进一步证实1,25(OH)2D3通过抑制人肾小球系膜细胞中PCNA的表达来抑制细胞增殖。

EGF是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用的一种多功能生长因子。EGF可减少细胞凋亡，并促进细胞增殖[11]。研究表明醛固酮通过激活依赖EGF结合EGFR的PI3K/Akt信号通路刺激肾小球系膜细胞增殖[12]。因此本研究设立EGF诱导肾小球系膜细胞增殖的微环境，进一步观察1,25(OH)2D3是否在细胞被诱导增殖的情况下，同样可以抑制细胞周期。结果显示，1,25(OH)2D3联合EGF干预后与EGF组比较，G1期细胞显著增多，S期、G2/M期细胞数目明显减少，提示1,25(OH)2D3可通过抑制细胞周期来抑制正常肾小球系膜细胞增殖，也可抑制EGF作用下的肾小球系膜细胞增殖；研究还发现1,25 (OH)2D3联合EGF干预后与EGF组比较，肾小球系膜细胞中的PCNA表达量也明显下降，提示1,25 (OH)2D3可通过抑制EGF作用下细胞PCNA的表达来抑制细胞增殖。

综上所述，1,25(OH)2D3可通过阻滞细胞周期和抑制PCNA的表达来抑制人肾小球系膜细胞的增殖，并可抑制EGF对人肾小球系膜细胞的增殖作用，但其具体作用机制有待进一步研究证实。

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（2014-09-03收稿2014-09-28修回）

（本文编辑陈丽洁）

Effects of 1,25(OH)2D3on proliferation and expression of PCNA of human glomerular mesangial cells

YIN Xuan1,ZHANG Hao1,CHEN Jianping1,MA Li1,ZHANG Chunjiang2,YANG Xiaoping2△
1 Medical College of Shihezi University,Xinjiang 832000,China;2 Department of Nephrology,the First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University△

ObjectiveTo investigate the effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3[1,25(OH)2D3]on PCNA expression and cell proliferation in human glomerular mesangial cells.MethodsThe cultured human mesangial cells,which was subcultured 3-8 generations,were randomly divided into four groups:normal control group(plus the DMEM medium containing 5%fetal bovine serum),proliferation in the control group(EGF group,plus 10 μg/L of EGF),general intervention group[VD group,plus 10-8mol/L of 1,25(OH)2D3],proliferation in the intervention group[EGF+VD group,plus 10 μg/L EGF and 10-8mol/L 1,25(OH)2D3]for treatment of 48 h.The cell cycle was detected by flow cytometry，and the expression of PCNA was detected by Western blot assay in four groups.Results(1)Compared with normal control group,G1phase cells were significantly reduced,S,G2/M phase cells were increased and PI index was higher in EGF group.And G1phase cells were significantly increased,S and G2/M phase cells were significantly decreased,and PI index was lower in VD group.Compared with the EGF group,G1phase cells were significantly increased in VD group and EGF+VD group,and S,G2/M phase cells decreased,PI index was lower.(2)Compared with normal control group,the expression of PCNA was higher in EGF group,and lower in VD group.Compared with EGF group,the expression of PCNA was lower in VD group and EGF+VD group.Conclusion1,25(OH)2D3inhibits the proliferation of human glomerular mesangial cells by arresting cell cycle and inhibiting the expression of PCNA protein.

glornerular mesangial cells;proliferating cell nuclear antigen;epidermal growth factor;cell proliferation; cell cycle;1,25(OH)2D3

R692

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.005

国家自然科学基金资助项目（81160090）

1新疆石河子大学（邮编832000）；2新疆石河子大学第一附属医院肾病科

尹璇（1988），女，硕士在读，主要从事肾小管疾病研究

△通讯作者E-mail:sbkyxp@163.com