张娜，史云芳，李晓洲，李岩，琚端，辛力，姚静怡，谢晓媛，刘殿芹，杨晓惠，岳天孚，张颖△

天津汉族女性人群HPRTB、DXS6803、DXS6809 STR基因座遗传多态性研究

张娜1，史云芳1，李晓洲1，李岩1，琚端1，辛力2，姚静怡2，谢晓媛2，刘殿芹1，杨晓惠1，岳天孚1，张颖1△

目的研究天津汉族女性人群HPRTB、DXS6803和DXS6809 STR基因座的遗传多态性，为快速产前诊断X染色体数目异常提供实验依据。方法收集150例无亲缘关系天津汉族女性外周血样本，应用QF-PCR扩增HPRTB、DXS6803和DXS6809 STR基因座、毛细管电泳检测扩增产物、ABI Prism GeneMapper v3.0软件分析数据，从每个基因座中挑选2个纯合子进行测序、命名。采用χ2检验验证3个STR基因座基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。用PowerStatsV12软件分析STR基因座的群体遗传学数据。结果150例样本均在24 h内扩增成功。HPRTB、DXS6803和DXS6809 STR基因座分别检出10、6、10个等位基因和22、12、29种基因型，其最常见等位基因分别是14、13、14，出现频率最高的基因型分别是14-14、12-13和13-14。基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2分别为10.554、5.783和15.355，均P＞0.05）。3个基因座的He分别为0.748、0.649、0.806，Ho分别为0.607、0.700、0.713，PIC分别为0.706、0.599、0.775，PD分别为0.894、0.814、0.931，PE分别为0.299、0.428、0.449。结论HPRTB、DXS6803和DXS6809 STR基因座在天津汉族女性人群具有高杂合度、高遗传信息量，是X染色体良好的遗传标记，可用于X染色体数目异常的快速产前诊断。

X染色体；串联重复序列；多态现象,遗传；天津；汉族；HPRTB；DXS6803；DXS6809；STR基因座；定量荧光聚合酶链反应

染色体病主要包括染色体数目异常和结构异常。染色体数目异常是临床上最主要的染色体病，研究表明13、18、21、X、Y染色体非整倍体占新生儿染色体数目异常的80%[1]。染色体核型分析是诊断染色体病的金标准，但其技术要求高，培养时间长，不能满足日益增长的产前诊断需要。利用定量荧光聚合酶链反应（quantitative fluorescence polymerase chain reaction,QF-PCR）扩增短串联重复序列（short tandem repeat,STR）基因座检测染色体非整倍体已经在欧洲许多产前诊断中心常规应用[2-3]。但是STR基因座的基因频率、基因型分布有地域和种族差异[4]。因此国际遗传学DNA委员会倡导建立各地区各种族的群体遗传学数据，它是进行个体识别、基因诊断等DNA分析技术的前提条件[5]。本课题组在前期完成应用QF-PCR快速产前诊断18和21号染色体非整倍体研究的基础上[6-7]，对天津汉族女性群体X染色体上的HPRTB、DXS6803和DXS6809 STR基因座的遗传多态性进行研究，为快速产前诊断X染色体数目异常提供实验依据，同时积累天津地区汉族女性X染色体的群体遗传学数据。

1 对象与方法

1.1 研究对象2010年9月—2011年12月根据知情自愿原则，收集籍贯为天津、三代居住在天津且无亲缘关系的汉族女性150例，年龄20～43岁，取其外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，-20℃保存。所有样本经染色体核型分析结果正常。

1.2 DNA的提取采用北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司的全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA，具体实验步骤按说明书进行。

1.3 引物选择根据NCBI的UniST数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists），选择HPRTB、DXS6803和DXS6809 STR基因座并确定引物序列，正向引物5′端均由荧光染料5-羧基荧光素（carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，5-FAM）标记，引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。HPRTB、DXS6803和DXS6809基因座的基本特征及引物序列见表1。

Tab.1The characteristics and primer sequences of STR loci HPRTB,DXS6803 and DXS6809表1 HPRTB、DXS6803和DXS6809基因座的基本特征及引物序列

1.4 PCR扩增体系总体积为25 μL，分别为Taq DNA聚合酶0.5 μL，dNTPs 1 μL，ddH2O 18 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，模板DNA 2 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。热循环参数分别为95℃5 min、95℃30 s、52～58℃30 s、72℃30 s，35个循环，72℃10 min。

1.5 PCR产物的毛细管电泳检测1.5 μL PCR产物加8.5 μL内标（内含变性剂甲酰胺）1 500 r/min离心30 s，94℃变性2 min，上机。设置相关参数，输入样品信息，POP7凝胶电泳30 min。ABI Prism GeneMapper v3.0软件分析数据，得出片段大小，整理结果。

1.6 测序从每个基因座中挑选2个纯合子扩增、纯化，与载体连接，在E.coli DH5α感受态细胞中转化、培养后菌斑鉴定，质粒提取并将验证正确的菌种用灭过菌的枪头挑3 mL (含100 mg/L Amp或50 mg/L Kan），37℃，250 r/min，培养过夜。取700 mL菌液和300 mL 50%甘油混匀，于-80℃冰箱保存。由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序。

1.7 命名每个STR基因座测定2个纯合子，对比分析后确定其重复序列及重复次数，并推算其余等位基因的重复数。根据国际法医血液遗传学会（the International Society for Forensic Haemogenetic,ISFH）等位基因命名原则命名各等位基因。

1.8 统计学方法直接计数法观察各基因座的等位基因频率。采用χ2检验验证3个STR基因座基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用PowerStatsV12软件进行统计分析，分别计算3个STR基因座的期望杂合度（expected heterozygosity,He）、观察杂合度（observed heterozygosity,Ho）、多态信息量（polymorphism information content，PIC）、个体识别率（power of discrimination,PD）、非父排除率（power of exclusion,PE）等群体遗传学数据。

2 结果

2.1 纯合子测序结果150例样本均在24 h内扩增成功。HPRTB STR基因座选择285、293 bp 2个片段进行测序，重复序列为TCTA，分别重复14、16次，命名为14、16。DXS6803基因座选择109、121 bp 2个片段测序，重复序列为GATA，分别重复11、14次，命名为11、14。DXS6809基因座选择253、273 bp 2个片段测序，重复序列为ATCT，分别重复11、16次，命名为11、16。

2.2 X染色体HPRTB、DXS6803和DXS6809 STR基因座基因频率HPRTB STR基因座检出10个等位基因，其片段长度和命名见表2。等位基因频率在0.006 7～0.373 3之间，最常见等位基因14，其频率为0.373 3；出现频率最低的为等位基因9、10、18、19，频率为0.006 7。DXS6803基因座检出6个等位基因，其片段长度和命名见表3。等位基因频率在0.003 3～0.520 0之间，最常见等位基因13，其频率为0.520 0；出现频率最低的为等位基因10、15，频率为0.003 3。DXS6809基因座检出10个等位基因，其片段长度和命名见表4。等位基因频率在0.003 3～0.256 7之间，最常见等位基因14，其频率为0.256 7；出现频率最低的为等位基因17、18，其频率为0.003 3。

Tab.2The allele frequency of STR locus HPRTB表2 HPRTB基因座等位基因频率

Tab.3The allele frequency of STR locus DXS6803表3 DXS6803基因座等位基因频率

Tab.4The allele frequency of STR locus DXS6809表4 DXS6809基因座等位基因频率

2.3 X染色体HPRTB、DXS6803和DXS6809 STR基因座基因型频率X染色体HPRTB、DXS6803和DXS6809基因座分别发现22、12、29种基因型，出现频率最高的基因型分别是14-14、12-13和13-14，见表5～7。HPRTB、DXS6803和DXS6809基因座基因型的观察值和理论值吻合良好，基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2分别为10.554、5.783和 15.355，均P＞0.05）。

Tab.5The genotype frequency of STR locus HPRTB表5 HPRTB基因座基因型频率

Tab.6The genotype frequency of STR locus DXS6803表6 DXS6803基因座基因型频率

Tab.7The genotype frequency of STR locus DXS6809表7 DXS6809基因座基因型频率

2.4 群体遗传学统计天津汉族群体X染色体HPRTB、DXS6803和DXS6809 STR基因座的He、Ho、PIC、PD、PE等群体遗传学数据见表8。

Tab.8The genetic polymorphism date of STR loci HPRTB,DXS6803 and DXS6809表8 HPRTB、DXS6803和DXS6809 STR基因座群体遗传学数据

3 讨论

我国出生缺陷发生率在5.6%左右，其中出生时临床明显可见出生缺陷的约有25万例[8]。在引起出生缺陷的遗传因素中，染色体非整倍体异常最常见。染色体核型分析是诊断染色体病的金标准。但是核型分析技术要求高，需要时间长，不仅给孕妇及家属带来一定的精神负担，而且会错过临床最佳的处理时机[9]。

近年来，QF-PCR在产前诊断常见染色体非整倍体中以其准确、快速、简便、自动化、高通量等优势得到广泛应用[10-12]。该方法是通过荧光引物扩增DNA样本，荧光信号变量与扩增产物变量成正比，通过足够灵敏的自动化仪器即可实现对扩增产物的荧光采集和分析。STR在人类基因组中分布较广，具有信息量大、易于检测、高度多态性并遵循孟德尔共显性遗传等特点，被认为是诊断染色体数目异常最适合的遗传标记。QF-PCR一般选择高遗传信息量的STR基因座作为检测位点，这样可以减少基因座均为纯合子的发生率，提高染色体数目异常的检测率。由于X染色体STR基因座位于同一条染色体上，需要考虑连锁和重组。不同连锁群的STR基因座在减数分裂时自由组合，独立遗传，选择不同连锁群的基因座可以提高单次检测的STR基因座的群体遗传学数据。本研究所选择的DXS6803和DXS6809基因座属于第二连锁群，HPRTB基因座属于第三连锁群。选择不同连锁群的STR基因座，保证了实验研究的顺利进行。

Gill等[13]提出把H≥0.7、PIC≥0.7、PD≥0.9作为高鉴别能力STR基因座的标准。本研究所选DXS6803、DXS6809、HPRTB基因座的He分别为0.748、0.649、0.806，Ho分别为0.607、0.700、0.713，PIC分别为0.706、0.599、0.775，PD分别为0.894、0.814、0.931，提示所选STR基因座基本符合高鉴别能力基因座的标准。本研究结果显示，DXS6803、DXS6809、HPRTB STR基因座遗传多态性与国内不同地区的研究相比，均属于高杂合度的基因座，但等位基因的数目及频率有差异。DXS6803、DXS6809、HPRTB STR基因座分别发现10、6、10个等位基因，李莉等[14]研究华东地区汉族无关个体X染色体上STR基因座的多态性，发现HPRTB、DXS6803和DXS6809基因座各有7、8、9个等位基因，杂合度为0.700 8、0.658 5、0.830 4，PIC为0.649 3、0.609 8、0.803 4，PD为0.860 4、0.835 7、0.947 0，PE为0.649 3、0.609 8、0.803 4。马腾等[15]检测山东汉族无关个体X染色体上的STR基因座，发现DXS6803和HPRTB基因座各有6、9个等位基因，PIC为0.432 5、0.660 0，PD为0.643 5、0.711 7，PE为0.093 0、0.393 5。李虹等[16]研究重庆地区汉族人群无关个体X染色体上基因座的遗传多态性，发现HPRTB基因座有9个等位基因，杂合度为0.769，PIC为0.79，PD为0.939，PE为0.543。将天津汉族群体的遗传学数据与其他地区相比，HPRTB基因座在华东、山东和重庆汉族人群中都发现等位基因11，但在天津汉族人群中未发现此等位基因，而发现等位基因18和19。DXS6803基因座在华东、山东人群中发现等位基因9，在天津汉族人群中未发现此等位基因，而发现等位基因15。DXS6809基因座在华东人群中为29-37，在天津人群中仅为9-18。结果表明建立本地区、本民族遗传多态性数据是必要的，积累本地区本民族的群体遗传学数据，选择高鉴别能力的STR基因座，可提高快速产前诊断X染色体非整倍体的准确率。

综上所述，DXS6803、DXS6809、HPRTB STR基因座在天津汉族女性人群具有高杂合度、高遗传信息量，是X染色体良好的遗传标记，可用于X染色体数目异常的快速产前诊断。

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（2014-06-20收稿2014-09-11修回）

（本文编辑陈丽洁）

Genetic polymorphisms of HPRTB,DXS6803 and DXS6809 STR loci in Tianjin Han female population

ZHANG Na1,SHI Yunfang1,LI Xiaozhou1,LI Yan1,JU Duan1,XIN Li2,YAO Jingyi2,XIE Xiaoyuan2,LIU Dianqin1, YANG Xiaohui1,YUE Tianfu1,ZHANG Ying1△
1 Department of Obstetrics and Gynecology,General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China; 2 Women and Children Health Care Center in Tianjin△

ObjectiveTo investigate genetic polymorphisms of HPRTB,DXS6803 and DXS6809 STR loci in Tianjin Han female population,and to provide experimental data in the prenatal diagnosis of aneuploidies accurately and rapidly. MethodsA total of 150 blood samples were collected in Tianjin Han population.QF-PCR and capillary electrophoresis were used in this study.The relevant data were analyzed by ABI Prism GeneMapper v3.0 software.Two homozygotes were selected from each locus for sequencing.The frequencies of the genotypes were checked using Chi-square test to verify Hardy-Weinberg Equilibrium.Data of genetic polymorphisms were calculated by PowerStatsV12 software.ResultsA total of 150 samples were successfully amplified in 24 hours.The 10,6 and 10 alleles and 22,12 and 29 genotypes were found respectively in HPRTB,DXS6803 and DXS6809 loci.The most common alleles were 14,13 and 14.The higher frequencies of genotypes were 14-14,12-13 and 13-14.No significant deviations from the Hardy-Weinberg equilibrium were observed in these three STR loci(χ2=10.554,5.783 and 15.355,respectively,P＞0.05).Values of He were 0.748,0.649 and 0.806 for these three STR loci respectively.Values of Ho were 0.607,0.700 and 0.713 respectively.Values of PIC were 0.706,0.599 and 0.775 respectively.Values of PD were 0.894,0.814 and 0.931 respectively.And values of PE were 0.299,0.428 and 0.449 respectively.ConclusionHPRTB,DXS6803 and DXS6809 STR loci were highly polymorphic,which are favorable genetic markers on chromosome X and can be used in rapid prenatal genetic diagnosis.

X chromosome;tandem repeat sequences;polymorphism,genetic;Tianjin;Han nationality;HPRTB; DXS6803;DXS6809;STR loci;quantitative fluorescence polymerase chain reaction

R394.3

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.004

天津市科技计划项目（11ZCGYSY02500）

1天津医科大学总医院妇产科医学遗传室（邮编300052）；2天津市妇女儿童保健中心

张娜（1989），女，硕士在读，主要从事妇产科遗传方面研究

△通讯作者E-mail：tjzyyzy@aliyun.com