顾 婕 马海乐 何荣海 刘雪姣

（江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室，镇江 212013）

响应面法优化小麦胚芽蛋白逆流脉冲超声辅助提取技术

顾 婕 马海乐 何荣海 刘雪姣

（江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室，镇江 212013）

研究小麦胚芽蛋白的超声辅助提取工艺。以脱脂小麦胚芽为原料，采用碱溶酸沉－逆流脉冲超声复合法提取其中的蛋白质，考察超声提取时间、料液温度、脉冲超声占空比、料液比等单因素对提取率的影响，确定出各因素最适取值范围；进一步采用响应面法优化工艺条件，得到小麦胚芽蛋白质提取最佳工艺：超声总时间为20 min，超声温度50℃、料液比为0.087 g/mL（1∶12）、占空比为0.625；研究表明，在此工艺条件下，蛋白质提取率为86.59%，较传统的一次碱提酸沉法提取率提高了49.06%。

超声提取 小麦胚芽 响应面法

2012年我国小麦产量超过1.2亿t，约占粮食总产量的20%［1］。小麦胚芽是整个麦粒中营养价值最高的部分，脱脂麦胚（Defatted wheat germ）是小麦胚芽制油后的残留物，含有大量优质蛋白以及谷胱甘肽等一些生理活性物质［2］，可被应用于增补食品中的蛋白质、强化食品中的氨基酸［3］，还是一种制备活性多肽的重要原料。

国内外很多研究人员利用碱溶酸沉法从脱脂小麦胚芽中分离出蛋白质［4－7］。就小麦胚芽而言，因为含有约30%的淀粉，在提取过程中导致体系黏度增加，影响了蛋白质的酸沉，回收率下降；同时在沉淀过程中许多淀粉也会随之沉淀，致使蛋白纯度较低。为此，马海乐等［8］建立了“碱提＋α淀粉酶水解＋酸沉淀”分离小麦胚芽蛋白的新方法，使得小麦胚芽蛋白的纯度和提取率显著提高。但是蛋白质的总得率还不很高，分析原因发现主要问题出现在碱提这一过程。为此，本研究提出利用逆流脉冲模式的超声波在碱提环节促进蛋白质的溶解，进一步提高蛋白质的提取率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦胚芽：河南省鲲华生物技术有限公司；α淀粉酶、氢氧化钠、盐酸、氯化钠及其他分析试剂：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FBTQ2000超声辅助提取/反应设备：无锡泛博生物工程有限公司；DDS738单相电子电能表：上海华立电表厂；UDK149全自动凯氏定氮仪：意大利VELP公司；877 Titrino plus自动电位滴定仪：瑞士Metrohm公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小麦胚芽蛋白超声辅助碱提基本工艺

称取50 g脱脂小麦胚芽粉按料水比1∶10（m/V）配制，加入5 g NaCl，用1mol/LNaOH将溶液pH调至11.0，超声辅助提取一定时间。随后在5 000 r/min条件下离心20 min，取上清液。将上清液pH调至6.5，按酶与底物比为0.3%添加α淀粉酶，在50℃水浴中水解1 h，随后沸水浴灭酶10 min，调pH值至4.0，待白色沉淀完全后，离心20 min，取沉淀，60℃恒温干燥10 h，得到粗小麦胚芽蛋白。

超声辅助提取/反应设备为本课题组自主研制的逆流聚能探头式超声设备，逆流循环速度控制在150 r/min，料液温度维持恒定。超声探头功率的测定为使用单相电子电能表测定超声1 h电表读数，测得实际功率为464 W。

1.3.2 超声辅助提取单因素试验设计

研究提取时间、料液温度、脉冲超声占空比、料液比4个单因素对小麦胚芽蛋白提取的影响。

提取时间：在料液比为1∶10、料液温度为50℃、占空比0.625的前提下，设定提取时间为10、20、30、40、50 min。

料液温度：在料液比为1∶10、占空比0.625、提取时间为最佳值的前提下，设定料液温度为20、30、40、50、60℃。

脉冲超声占空比的影响：在料液比为1∶10、提取时间和料液温度为上一步确定的最佳值的前提下，设定占空比为 0.417（10∶14 s）、0.5（10∶10 s）、0.625（10∶6 s）、0.714（10∶4 s）、0.833（10∶2 s）。

料液比：在提取时间、料液温度和占空比为最佳值的前提下，设定料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20。

1.3.3 响应面试验设计方案

在单因素试验基础上，采用方差分析筛选出对蛋白质提取率影响较大的因素，采用Box－Behnken模型设计优化试验方案。

1.3.4 粗蛋白质质量分数测定和提取率计算

粗蛋白质量分数参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法，蛋白质换算系数为5.83。蛋白质的提取率计算：

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 提取时间对提取率的影响

超声提取时间对蛋白质提取率和质量分数的影响如图1所示。

图1 不同超声提取时间下的蛋白质量分数和提取率

由图1可知，超声提取20 min蛋白质的提取率和质量分数就达到一个较高的水平。随着提取时间的延长，蛋白质含量基本稳定，而且40 min后开始下降；而提取率有一定幅度的增长，到了40 min后也开始下降。组利用原子力显微镜观察超声波对酪蛋白以及玉米蛋白结构影响研究时发现，在处理前期，蛋白质颗粒迅速细化，一定时间之后开始出现分子聚集现象，主要原因在于处理前期超声波因为振动引起蛋白颗粒疏松，传质效果改善；到了后期，超声波开始导致蛋白质疏水键外露，疏水性增加，溶出的蛋白分子出现聚集，溶解度变差［9－11］。20 min之后蛋白质质量分数基本稳定，尽管提取率还在增加，但幅度很小，所以选取超声提取时间为20 min。

2.1.2 料液温度对提取率的影响

料液超声温度对蛋白质提取率和质量分数的影响如图2所示。

图2 不同超声温度下的蛋白质量分数和提取率

由图2可知，随着温度升高，蛋白质提取率逐步增高，在50℃达到最大值，随后下降。分析原因，随着温度升高，体系中各组分之间充分接触，增加了超声所引起的热效应和空化效应，便于蛋白质从组分中脱离，蛋白质的提取率得到增高。另一方面，随着温度增高，部分蛋白质随之变性，影响了蛋白质的溶解性，使之提取率下降，同时也会导致蛋白质营养性质的破坏［12－13］。由超声的物理特性可知，随着温度的增加，表面张力系数（σ）及黏滞系数（η）下降，空化阈值下降，使空化泡的产生变得容易，空化效应加强，引起提取率上升；但当温度进一步增加，蒸汽压（Pv）增高幅度增加，空化强度或空化效应下降，导致提取率下降［14］。选择50℃为最佳提取温度。

2.1.3 脉冲超声占空比对提取率的影响

占空比是指1 min内，超声作用时间所占的比例。占空比反映的是超声波连续工作的时间［15］。占空比对蛋白质提取率和质量分数的影响见图3。

如图3所示，低占空比条件下提取率较低，主要原因是相对于工作时间而言间歇时间过长，不仅是液体受到超声处理的绝对时间较短，更重要的是上一个脉冲施加给处理对象的应力已经完全恢复，才受到再次超声脉冲的冲击，因此促溶效果不很显著。随着占空比增加，超声波实际发射超声波信号的时间得到延长，空化效应增强［16］，提取率和质量分数也有所增加，在占空比达到0.625即超声时间工作10 s，间歇6 s时，提取率和质量分数达到最大值；再增加占空比就使得反应体系内温度增高，蒸汽压（Pv）增高幅度增加，空化强度或空化效应下降，导致提取率下降。据此，最佳提取占空比为0.625。

图3 不同超声占空比下的蛋白质量分数和提取率

2.1.4 料液比对提取率的影响

由图4可知，随着料液比减小，小麦胚芽蛋白提取率先增加后降低，在料液比为1∶10的时候提取率达到最高。这是因为随着料液比的减小，溶剂量加大，溶解溶质的能力自然增加。但随着料液比的进一步下降，溶液愈来愈稀，其黏滞系数η和表面张力系数σ降低，导致超声波要求的空化阈值虽然减少，但是空化泡崩溃时伴随产生的最大温度Tmax与最大压力Pmax值也会降低，空化效果降低，因此提取率降低［17］。而蛋白质质量分数随着料液比增加逐步增加，趋于平衡。由于料液比增加需要的生产成本也会增加，所以选择料液比1∶10比较合适。

图4 不同料液比下的蛋白质量分数和提取率

2.2 响应面设计及结果分析

根据单因素试验结果，超声辅助提取时间在20 min，温度为50℃，料液比为1∶10，超声占空比为0.625时小麦胚芽蛋白提取率最大。通过SPSS单因素分析，温度、料液比、占空比对提取率影响较大，选择这3个因素进行响应面优化，超声提取时间固定为20 min。试验因素和水平见表1，试验设计以及结果见表2。

表1 Box－Benhnken中心组合设计的因素和水平表

表2 Box－Benhnken试验设计及结果

2.2.1 数值模型方程

用Design－Expert8.0.6软件对表2中数据进行多元回归拟合，建立蛋白提取率（Y）的二阶响应回归模型，进而分析各试验因素X对于响应值Y的影响。小麦胚芽蛋白提取率的回归方程如下：

2.2.2 回归与方差分析

回归模型方差分析结果见表3。

表3 方差分析表结果

由表3可知，模型P＜0.000 1，本研究所得回归模型极其显著。模型Radj2＝0.953 3，该模型可以解释95.33%响应值的变化，因此模型与实际拟合较好。模型一次项X1，X2，二次型X12对响应值蛋白质提取率Y影响极其显著（P＜0.000 1）；二次型对响应值影响显著（P＜0.05）；3个因素对蛋白质提取率影响依次为X2＞X1＞X3，即料液比＞超声温度＞超声占空比；交互项X1X2对蛋白质提取率的影响显著；X1X3，X2X3对蛋白质提取率的影响不显著；结果表明，各因素对小麦胚芽蛋白质提取率影响不是简单的线性关系。

2.2.3 响应面因素交互作用分析

图5 各因素交互作用对提取率影响的响应面及等高线图

图5为各个因子交互作用的响应面3D和等值线分析图。从响应面的最高点和等值线可以看出，在所选的范围内存在极值，既是响应面的最高点，同时也是等值线最小椭圆的中心点［18］。由图5a可知，蛋白质提取率随着料液比和温度呈现增加后下降的趋势，等高线逐步呈现椭圆形，说明X1X2交互作用较强，编码值较大的X1和X2的响应值较低，可能是因为随着温度和料液比增加，溶剂体系内部渗透压达到了动态平衡，且伴随着热效应产生，蛋白质发生变形，从而提取率降低［19］。由图5b可知，随着温度和占空比增加，蛋白质提取率均呈现先上升后下降趋势，二者等高线是圆形，说明X1X3交互不明显。由图5c可知，随着料液比和占空比增加，蛋白质提取率有缓慢下降趋势，二者等高线是明显圆形，X2X3交互不明显。

2.2.4 数值模型验证

通过响应面软件分析得出小麦胚芽蛋白提取最佳条件为：超声温度49℃、料液比为0.087 g/mL（1∶12）、占空比为0.609，蛋白质提取率的预测值为87.18%。将最佳条件修正为温度50℃、料液比为0.087 g/mL（1∶12）、占空比为 0.625即超声 10 s，间歇6 s，在此条件下提取小麦胚芽蛋白，实际提取率为86.59%，产品中蛋白质量分数为68.90%，提取率与理论预测值相比相对误差＜5%。因此，该模型能较好预测实际小麦胚芽蛋白质提取率，有实用价值。

2.2.5 对照试验及结果分析

根据1.3.1方法采用不加超声的传统碱溶酸沉提取方法进行小麦胚芽蛋白的提取试验，将20 min的超声波辅助提取改为30 min的磁力搅拌提取，将试验结果与本研究最佳条件下所得结果进行对照。传统一次碱提酸沉所得到的麦胚蛋白提取率为58.09%，蛋白质质量分数为72.24%。相比之下，采用超声辅助提取法蛋白质的提取率提高了49.06%，因此是一种可取的方法。

3 结论

采用碱溶酸沉－逆流超声复合法提取麦胚蛋白，结果证明超声作用效果明显，蛋白质提取率得到明显提高。试验表明影响蛋白质提取率的因素顺序为料液比＞超声温度＞超声占空比。在单因子试验基础上，将响应面方法应用到逆流超声辅助提取小麦胚芽蛋白的提取工艺的优化。在总超声时间20 min下，确定了最佳工艺条件：超声温度50℃、料液比为 0.087 g/mL（1∶12）、占空比为 0.625。响应面的预测值为87.18%。蛋白质实际提取率为86.59%，较传统的一次碱提酸沉法提取率提高了49.06%。

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Optimization of Ultrasonic Extraction of Protein from Defatted Wheat Germ by Response Surface Methodology

Gu Jie Ma Haile He Ronghai Liu Xuejiao
（Jiangsu Provincial Key Laboratory for Physical Processing of Agricultural Products，Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

The study was aimed to establish an optimized method by ultrasonic pretreatment to prepare DWGP.In the experimentof the paper，protein isolates have been prepared from defatted wheatgerm（DWG）by alkaline extraction and isoelectric precipitation combined with ultrasonic pretreatment.Ultrasonic time，ultrasonic temperature，pulsemode and solid－to－solvent ratiowere inspected respectively as every single factor to determine the optimal value for experiment.Then Response Surface Methodology（RSM）was used to optimize extraction conditions to calculate maximum extraction efficiency.The results showed that the optimum extraction conditions were：ultrasonic time of 20 min，ultrasonic temperature at50℃，solid－to－solvent ratio at1∶12，pulsemode as10 s on and 6 s off.On the conditions，the average protein recovery was86.59%，which almost fitted themodel calculation value 87.18%.Compared with traditional alkaline extraction and isoelectric precipitation，the protein recovery was increased by 49.06%.

ultrasonic extraction，defatted wheat germ，response surfacemethodology

TS210.9

A

1003－0174（2015）08－0019－05

公益性行业（农业）科技专项（201303071），国家863计划（2013AA102203）

2014－03－24

顾婕，女，1989年出生，硕士，食品物理加工

马海乐，男，1963年出生，教授，食品物理加工