赵云霞 马 琳 蔡兆根

（蚌埠医学院病理生理学教研室；1蚌埠医学院病理学教研室，蚌埠医学院第一附属医院临床病理科，安徽233030）

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，发病率逐年提高，严重影响病人的身心健康。淋巴转移是乳腺癌重要转移途径，且发生于肿瘤早期，是导致预后不良的重要因素，因此抗淋巴转移成为乳腺癌治疗的新方向，期望以此取得乳腺癌治疗的新突破。研究表明，肿瘤淋巴转移是由新生淋巴管介导［1］。目前研究最广泛的促进淋巴管新生的信号系统是血管内皮生 长 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）及血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）－3。乳腺癌中对此信号系统中的VEGF－D／VEGFR－3研究未见报道，本研究旨在探讨VEGF－D／VEGFR－3在乳腺癌淋巴管生成中的作用及其临床预后意义。

材料和方法

1.标本

收集2008年6月至2012年6月间蚌埠医学院第一附属医院病理科（蚌埠医学院病理学教研室）乳腺癌手术切除的存档石蜡标本120例，所有患者术前未接受放、化疗及内分泌治疗，标本经病理确诊。年龄31－85岁。按照 WHO提供的方法进行分级［2］，Ⅰ级18例；Ⅱ级78例；Ⅲ级24例。按TNM分期［2］，肿瘤大小分为3组，最大直径≤2.0cm 者12例；直径为2.0－5.0cm者88例；直径＞5.0cm 者20例。本组病例中发生淋巴结转移76例；未转移44例。随机选择30例乳腺良性增生性病变标本作为对照。

2.试剂和方法

标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片，厚4μm，分别行HE染色和免疫组织化学染色（S－P法），用已知阳性组织切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。兔抗人VEGFR－3多克隆抗体购自北京中杉金桥公司；兔抗人VEGF－D多克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司；鼠抗人Podoplanin单克隆抗体购自上海晶美生物技术有限公司。

3.结果判断

VEGFR－3蛋白在乳腺癌细胞中的表达定位于细胞质，VEGF－D蛋白阳性表达亦定位于细胞质，以胞质出现明显的黄色或棕黄色颗粒视为阳性着色。判定标准：以染色强度和阳性细胞比例评定阳性表达。染色强度：不着色为0分，着色弱为1分，着色清晰为2分，着色强为3分。阳性细胞百分率：无细胞着色为0分，着色细胞0－10%为1分，10%－30%为2分，30%－50%为3分，≥50%为4分。上述两项相加，0－2分为阴性（低表达），3分为（＋），4～5分为（＋＋），6分为（＋＋＋），7分为（＋＋＋＋）（3～7分为高表达）。

Podoplanin蛋白阳性表达为淋巴管内皮细胞着棕黄色或者棕褐色。本实验中具有管腔结构的Podoplanin阳性淋巴管才用于计数LVD值。LVD值的计数参照Bimer等［3］的方法，先于低倍镜视野下确定淋巴管密集区域（热点），然后在40×10倍放大视野下计数，随机选取3个区域高倍镜下淋巴管平均数作为肿瘤新生淋巴管密度值。每张切片由两名病理医师在双盲情况下分别计数。

4.统计学处理

使用SPSS13.0统计软件进行数据分析，采用χ2检验和Fisher精确检验、t检验及Spearman等级相关分析，P＜0.05表示有统计学意义。

结 果

1.VEGFR－3蛋白的表达

VEGFR－3蛋白阳性表达定位于乳腺癌细胞质，呈棕黄色颗粒（图1）。120例乳腺癌组织中VEGFR－3蛋白阳性表达56例，阳性率为46.67%，对照组中阳性表达6例，阳性率为20.00%，两组有显著性差异（P＜0.01）。VEGF－D蛋白阳性表达99例，阳性率为82.50%，对照组中阳性表达7例，阳性率为23.33%，两组差异有显著性（P＜0.01）（图2）。

2.VEGFR－3蛋白表达与LVD值的关系

Podoplanin蛋白阳性表达定位于乳腺癌周围淋巴管内皮细胞的胞质或胞膜，呈棕黄色颗粒（图3）。乳腺癌组织56例VEGFR－3蛋白表达阳性组中，其癌周LVD值为17.86±6.09，VEGFR－3蛋白表达阴性组的癌周LVD值7.52±4.09，两组差异具有统计学意义（P＜0.01）（表1）。

图1 VEGFR－3在乳腺癌中阳性表达定位于胞质（SP法×100）图2 VEGF－D在乳腺癌中阳性表达定位与胞质（SP法×100）图3 Podoplanin在乳腺癌旁间质淋巴管的表达（SP法×100）Fig.1VEGFR－3expressed in cell plasmas of mammary carcinoma（SP method×100）Fig.2VEGF－D expressed in cell plasmas of mammary carcinoma（SP method×100）Fig.3Podoplanin expressed in mammary carcinoma（SP method×100）

表1 乳腺癌组织中VEGFR－3蛋白表达与LVD值的关系Table 1 Relationship between the expression of VEGFR－3protein and the lymphatic microvessel density in breast carcinoma

3.VEGFR－3蛋白表达与临床病理指标的关系

乳腺癌组织中淋巴结转移组VEGFR－3蛋白表达阳性例数为46，阳性率为60.53%；无淋巴结转移组VEGFR－3蛋白阳性率为22.73%，经统计学分析，VEGFR－3蛋白表达与乳腺癌淋巴结转移显著相关（x2＝22.173，P＜0.01），与年龄、组织学分级、肿瘤大小、病理类型、雌激素受体（estrogen receptor ER）和孕激素受体（progesterone receptor PR）的表达无相关性（P＞0.05）（表2）。

表2 乳腺癌组织中VEGFR－3蛋白表达与乳腺癌临床病理指标的关系（n）Table 2 Correlation between expression of VEGFR－3and clinicopathological features in breast carcinoma（n）

4.VEGFR－3蛋白表达与VEGF－D蛋白表达的关系

VEGFR－3蛋白主要表达于乳腺癌细胞胞质，在脉管内皮细胞和间质纤维细胞也有少量表达。VEGF－D蛋白表达阳性组中VEGFR－3表达阳性率为52.53%，高于VEGF－D蛋白表达阴性组的19.05%，两组差异具有显著性（P＜0.01）（表3）。

表3 乳腺癌组织中VEGFR－3蛋白表达与VEGF－D蛋白表达间的关系Table 3 Relationship between the expression of VEGFR－3protein and the expression of VEGF－D protein in breast carcinoma

讨 论

转移是肿瘤预后不良的重要决定性因素之一，乳腺癌病人往往在肿瘤早期就已发生淋巴转移，导致乳腺癌治疗效果差。以往，认为淋巴转移过程是脱落的肿瘤细胞通过原有淋巴管引流到达淋巴结，是一个被动的过程。而Saharinen等［1］的研究表明，淋巴转移是一个主动过程，在肿瘤发生、发展的过程中某些细胞因子的异常表达促使肿瘤周围淋巴管的新生，新生的淋巴管导致肿瘤的转移。长期以来对肿瘤淋巴转移的研究远远落后于血道转移，是由于缺乏特异的淋巴管内皮标记物。对于淋巴管检测结果的报道有较大差别，原因在于检测方法的不一致和检测标准的缺失。目前认为Podoplanin是淋巴管内皮的特异性标记物，是检测淋巴管最可靠的指标［4］。本研究以Podoplanin标记瘤周淋巴管，计数LVD值，结果表明乳腺癌周LVD值显著高于对照组，说明瘤周确有新生淋巴管，提示肿瘤转移与新生淋巴管有一定关系，这与目前大多数的研究是相一致的。

VEGF家族及其受体是目前被认为与淋巴管新生关系最为密切的信号转导系统。对VEGF－C／VEGFR－3研究较多，而对于 VEGF－D／VEGFR－3较少关注，且在乳腺癌中其表达及预后价值存在较大争议。Salameh等［5］以人脐静脉为研究对象阐述了VEGFR－3介导的信号通路，VEGFR－3被其配体活化后将发生自身磷酸化，进而活化ERK、AKT和JNK通路，将配体信息传递至胞核，从而促进内皮细胞的增殖和迁移。VEGFR－3不仅在脉管内皮细胞表达，肿瘤细胞内也有VEGFR－3表达，通过自分泌和旁分泌的方式［6］促进肿瘤的淋巴转移［7］。有研究［8］认为 VEGFR－3 介 导 的 淋巴管生成主 要 与VEGF－C有关，与 VEGF－D无关，但也有报道［9、10］认为VEGF－D与淋巴管生成和淋巴转移具有密切关系，甚至可以作为乳腺癌独立的预后指标。本研究结果显示，乳腺癌组织中 VEGF－D、VEGFR－3蛋白表达显著高于对照组，且在局部淋巴结转移阳性组VEGFR－3的表达阳性率显著高于阴性组，提示在乳腺癌进展中 VEGFR－3、VEGF－D表达增强，并与癌细胞的浸润和转移密切相关，预示乳腺癌预后不良。本研究中发现，VEGFR－3在肿瘤间质的炎细胞（单核细胞、巨噬细胞）中也有表达。这可能与 Wong等［11］认为的肿瘤组织间质中的炎细胞在淋巴管生成过程中也同样起作用有关，但其确切作用及机制还需更深入的研究。

研究结果还显示，乳腺癌组织中VEGFR－3蛋白表达阳性组瘤周LVD值显著增高，VEGF－D蛋白表达阳性组中VEGFR－3蛋白表达阳性率显著高于阴性组。此结果提示，乳腺癌组织中VEGF－D的高表达诱导并上调VEGFR－3的表达，并使后者活化，通过活化的VEGFR－3介导的信号转导通路促使新的淋巴管生成，导致乳腺癌的浸润和转移。因此认为，在乳腺癌组织中 VEGF－D、VEGFR－3高表达与预后不良密切相关，可以作为乳腺癌的预后指标。VEGF－D和VEGFR－3被认为是胃腺癌和卵巢上皮癌的独立预后指标［12、13］，其能否作为乳腺癌独立预后指标还需加大样本量做进一步的研究。

抗淋巴转移治疗已成为目前乳腺癌治疗的新途径，动物实验已取得初步进展。如在小鼠乳腺癌模型中应用VEGFR－3抗体可减少肿瘤的淋巴结转移［14］，应用VEGFR－3的抑制剂可有效抑制淋巴结转移和远处转移［15］，但VEGFR－3所介导的信号通路有多条，为了使治疗更为精确和有效，还需对VEGF－D／VEGFR－3通路诱导淋巴管生成的机制做更深入的研究。但VEGF－D／VEGFR－3所涉及的信号转导通路将是乳腺癌抗淋巴治疗的新靶点。

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