姬云涛 王 娟 张 会 屈长青 徐幸莲

（1阜阳师范学院生命科学学院 安徽236037；2南京农业大学食品科技学院，江苏210095）

羊栖菜（Sargassum Fusiforme（Harv.）Setchell）系褐藻门马尾藻科马尾藻属植物，别名玉草、海草、六角菜，又称海大麦、鹿角尖等，据南齐陶弘景的《神农本草经》及李时珍的《本草纲目》记载“羊栖菜味苦、咸，寒而无毒；主治瘦瘤结气，散颈下硬核痛，痈肿痛痕坚气，腹中上雷鸣，下十二水肿。疗皮间积聚暴溃，瘤气结热，利小便”。还有“治疗奔脉气脚气、水气浮肿、宿食不消”等功能［1］。现代药理研究表明，羊栖菜多糖（SFPS）对心血管功能有影响，可以增强机体免疫力，并具有一定的抗肿瘤、降脂和降血糖作用［2，5］，但对脂肪代谢的影响尚不清楚。本实验以秀丽隐杆线虫为模型检测SFPS的抑脂作用，同时采用大鼠外翻肠囊法，考察不同浓度SFPS对小肠吸收的影响。

材料和方法

1.材料

1.1 秀丽隐杆线虫及食物

N野生型秀丽隐杆线虫（C.elegans）、大肠杆菌OP50及SD大鼠（雄性，体重220±10g）由抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心提供。

1.2 药品及试剂

NGM培养基、线虫裂解液，M9溶液，油红O染液，蒽酮、硫酸。

小肠缓冲液：NaCl（8.0g／L）、KCl（0.2g／L）、CaCl2（0.2g／L）、NaHCO3（1.0g／L）、NaH2PO3（0.05g／L）、MgCl（0.1g／L），配好后置于4℃冰箱中保存备用。

Sevage去蛋白液：氯仿与正丁醇体积比为4∶1制成的混合液，置于4℃冰箱中保存备用

2.方法

2.1 SFPS提取、纯化及NGM培养基的配制

参照蒋定文等方法［6］，将烘干后的羊栖菜置于粉碎机中适当打碎，称取20g于烧杯中，按1：20加水，静置过夜，次日放入超声波清洗仪中震荡2次，每次40min，中间间隔10min。抽滤三次，留滤液。旋转蒸发至30ml。将得到的羊栖菜粗多糖溶液与Sevage去蛋白液按3∶1混合，除去蛋白质。再将去蛋白后的溶液与氯仿按1∶1混合，除去脂溶性物质。最后将去除脂质后的溶液与95%的酒精混合配成终浓度为80%的酒精多糖溶液，放在4℃冰箱中静置12h，3000r／min离心5min得深棕色沉降物，再用丙酮和无水乙醇分别洗涤沉降物，将洗涤后所得粗多糖干燥至粉末，常温保存备用。

2.2 NGM培养基的配制、线虫的培养、同步化及虫体油红O染色

将SFPS分别配制成不同浓度（15、30和45 mg／ml）的NGM培养基，并设置对照组。线虫的培养、同步化及虫体油红O染色方法参照文献［7］。

2.3 外翻肠囊的制作［8］

取健康大鼠，禁食24h（自由饮水），断颈椎处死，沿腹中线剪开皮肤与肌肉，打开腹腔，分离出小肠放入准备好的小肠缓冲液中，用缓冲液冲洗小肠表面，并将浆膜层外的脂肪组织摘除干净。剪取一段5cm小肠，用圆头细玻璃棒小心将肠段翻转使黏膜层在外，浆膜层在内，将内容物清洗干净，用夹子夹紧肠段的一端，向肠囊内注入0.5ml空白小肠缓冲液，再用夹子夹紧肠段的另一端，滤纸吸干肠段表面多余液体，放入含有不同浓度SFPS（浓度分别为0.03、0.06、0.30和0.60mg／ml）小肠缓冲液的锥形瓶中，通入空气，置于37℃水浴中保温。在吸收开始1h后，取出肠囊，放入小肠缓冲液中清洗3次，取出肠囊内的所有内液，然后放入离心管中4000r／min离心15min，取上清液用蒽酮硫酸法进行显色反应，测定在625nm处的OD值。

结 果

1.虫体染色观察

在光学显微镜下观察，经油红O染色处理后，虫体有不同程度的着色现象；与对照相比，在含SFPS的NGM培养基上生长的虫体，虫体内染色均比生长在正常NGM培养基上的虫体颜色浅，而且SFPS浓度越高，虫体染色越浅（图1）。

图1 不同浓度SFPS培养的秀丽隐杆线虫的油红O染色效果 （A：对照；B、C和D含SFPS的浓度分别为15 mg／ml，30mg／ml，45mg／ml）Fig.1Lipid droplet in Caenorhabditis elegans were strained by oil red O（A：control，B，C and D show C.elegans were cultured in different NGM with 15，30and 45mg／ml SFPS.）

2.线虫染色后裂解经萃取所得吸光度

线虫在不同浓度的SFPS（0、15、30和45mg／ml）NGM培养基上生长后，可见随着SFPS浓度的升高，线虫体内的OD值呈现出一定的曲线变化，与对照组相比，吸光度呈现下降趋势，15mg／ml处理组与对照组差异显著，30mg／ml以上处理组则差异极显著（P＜0.01），（图2）。

图2 不同浓度SFPS对线虫脂肪沉积在490nm处吸光度A值（图中a，b差异显著P＜0.05；b，c差异显著P＜0.05；a，c差异极显著P＜0.01）Fig.2OD490Value of different concentrations of SFPS on lipid droplets of C.elegans.Different letters indicate significant difference map

3.羊栖菜多糖在大鼠小肠中的吸收

蒽酮－硫酸法检测原理是糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量检测。本实验用蒽酮－硫酸法对不同浓度SFPS（0、0.03、0.06、0.3和0.6mg／ml）在小肠的吸收情况进行了测试，发现当SFPS浓度小于0.3mg／ml时，小肠肠囊对SFPS的吸收效果与对照组差异不显著，但当SPFS浓度增加到0.6mg／ml时，出现较强的吸收峰，差异极显著。

图3 .不同浓度SFPS在大鼠小肠的吸收情况（OD625）Fig.3OD625Value of different concentrations of SFPS in small intestinal ofrat.Different letters indicate significant difference map

讨 论

羊栖菜在我国沿海地区十分常见，其提取物SFPS是一种具有多种药理活性的酸性多糖，表现出一定的抗肿瘤、降脂和降血糖作用［5，9］。王尊文等发现［10］，羊栖菜多糖能显著降低高血脂模型大鼠血中胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的含量，同时可增加高密度脂蛋白的含量。本文采用油红O染色法对在含不同浓度羊栖菜多糖的NGM培养基上生长的秀丽隐杆线虫进行检测发现，与对照组相比，在含不同浓度SFPS的NGM培养基上生长的线虫虫体，油红O染色较浅，且随着浓度的升高，虫体着色越来越浅；随后将虫体裂解，异丙醇萃取，在490 nm处检测吸光值，结果显示随着SFPS浓度的增加，OD值呈现减小的趋势，说明线虫体内脂质含量随着SFPS的增加而减少，证明羊栖菜多糖在线虫体内也表现出一定的抑制脂肪沉积的作用。

SFPS在处理小鼠后与线虫后，均表现出一定的降脂作用［10］，作为一种酸性多糖，其中的褐藻酸由甘露糖醛酸和古罗糖醛酸构成，在生物机体内几乎不被消化吸收，可在肠道内吸水后形成胶体，阻止脂类物质向小肠壁扩散，从而减少了机体对脂肪的吸收［13］。离体外翻肠囊模型是一种简单又快速的检查药物吸收以及确认肠道代谢的方法［11，12］。本实验采用外翻大鼠肠囊法研究了SFPS在大鼠小肠中的吸收情况，发现小肠对SFPS的吸收的确表现一般，SFPS浓度低于0.3mg／ml时，其吸收效果与对照组相比，差民不显著，这可能与其在肠道内吸水后形成胶体有关。但在实验中，我们也发现，当SFPS浓度为0.6mg／mL时，出现一个较明显的吸收峰，与对照组相比，差异极显著，这是否因为形成了较高的浓度差所致？相关机制还有待于进一步的研究。

［1］周峙苗.羊栖菜多糖的提取和纯化研究.浙江工业大学硕士研究生学位论文，2003，12：13－14

［2］季宇彬，高世勇，张秀娟.羊栖菜多糖诱导肿瘤细胞凋亡的研究.中国中药杂志，2004，29（3）：245－247

［3］Manish S，Patnkar，Sergio Oehninger，et al.A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities.The Journal of Biological Chemistry，1993，（29）：21770－21776

［4］张燕平，戴志远，王宏海等.羊栖菜高活性膳食纤维提取工艺的研究.中国食品学报，2005，5（3）：66－69

［5］王兵，李靖，马舒冰等.羊栖菜多糖降血糖作用的实验研究.中国海洋药物，2000（3）：33－35

［6］蒋定文，沈先容，贾福星等.羊栖菜多糖的提取及纯化.食品科学，2007：136－137.

［7］屈长青，宫雯珺，常好才等.不同浓度亳菊水提物对秀丽隐杆线虫脂滴凝聚影响观察.中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（6）：528－530.

［8］梁新丽，赵国巍，罗云等.外翻肠囊法研究白芷有效组分对配伍“对药”有效成分肠吸收的影响.中国实验方剂学杂志，2013，17：193－197.

［9］李八方，毛文君，曹立民.羊栖菜多糖对高血脂模型大鼠血脂的影响.中国水产科学，2000，7（2）：56－58.

［10］王尊文，华玉琴，李国平等.羊栖菜多糖对高血脂模型大鼠血脂和抗氧化功能的影响.中国海洋药物，2008，06：13－15.

［11］陈晓萌，张迎春，林朔等.外翻肠囊法发现元胡止痛片吸收成分群的研究.中国中药杂志，2012，13：2005－2011.

［12］王彦荣，何应，刘绛光.黄芪多糖小肠吸收机制研究.天津大学硕士研究生学位论文，2007.

［13］孙福璋，韩天国.海洋生化制备技术.青岛：青岛海洋大学出版社，1993：19.