刘 敏 赵 健 吴 锋 黄 锐 侯良芹 熊克仁

（皖南医学院人体解剖学教研室，安徽 芜湖241000）

生长休止蛋白7（Growth arrest－specific protein 7，Gas7）是Gas基因家族中的一员，首次发现于体外培养的生长停滞的成纤维细胞［1］，在体内主要表达于神经系统，如成年大鼠大脑皮质、海马和脊髓的神经元均有表达［2－4］。最近资料显示，Gas7不但促进神经元轴突的形成和延伸，还可以调节神经元的凋亡［5，6］。Gas7在成年大鼠小脑皮质有表达，且在小脑皮质的Purkinje细胞高表达［7］，但在大鼠小脑皮质发育过程中的动态表达尚未见报道。小脑皮质位于小脑的表层，是小脑接收和处理信息的主要部位，是小脑行使功能的重要结构，在损伤、发育异常等疾病的发病过程中产生严重的病理改变，损伤后可引起共济失调、肌张力改变和病态运动等［8－10］。本实验采用 RT－PCR方法和免疫组织化学方法观察Gas7mRNA和蛋白在大鼠小脑皮质不同发育阶段的动态表达及分布，为研究Gas7基因是否参与小脑皮质发育的调控，从而为丰富小脑皮质发育调控的基因网络提供参考资料，有助于揭示小脑有关疾病的病理过程，从而为治疗方案提供新的思路。

材料和方法

1.实验动物及分组

将孕18.5d和20.5d母鼠引颈处死，取出胚胎鼠。实验选取胚胎18.5d（E18.5）、E20.5、出生当天（P0）、出生第7d（P7）、P14、P21和 Adult（2月龄）共7组不同时间点大鼠，每组随机选取12只，其中6只用于RT－PCR实验，6只用于免疫组化实验。

2.主要实验试剂

山羊抗Gas7抗体购自Santa Cruz公司；TRNzol－A＋总 RNA 提取试剂、Quant cDNA 第一链合成试剂盒、PCR试剂盒和Marker I均购自北京天根生化科技有限公司；大鼠Gas7和β－actin引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成，HRP标记兔抗山羊IgG和HRP－DAB增强型显色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

3.RT－PCR方法

每组大鼠取小脑皮质，按TRNzol－A＋试剂盒说明书提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解，紫外分光光度计测7组总RNA浓度，每组均取1μg的总RNA进行逆转录合成cDNA，步骤按照逆转录试剂盒说明书。再以cDNA为模板进行 PCR 扩 增，Gas7 上 游 引 物 序 列：5＇－AAGAAGAGTCTGGCCGATGA－3＇下游引物序列：5＇－CTCGACTGTGCTTTGGTTGA－3＇，目 的 片 段 为492bp。以β－actin为内参，其上游引物序列：5＇－CAGGCACCAGGGCGT－3＇，下游引物序列：5＇－ATGGCTGGGGTGTTGAAG－3＇，扩增片段为282bp。PCR扩增反应条件为，95℃预变性3min，后Gas7进行34个循环（β－actin 29个循环），每一次循环的条件是94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸40 s。循环结束后再72℃充分延伸5min。PCR产物测定，取5μl的DNA样品，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统对所得结果进行拍照，并测定各组不同时期大鼠小脑皮质Gas7和β－actin DNA条带的平均光密度值（OD值），mRNA相对表达＝样品 OD值／β－actin OD值。

4.免疫组织化学方法

各时间点小脑组织放入4℃的4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定24h，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，连续冠状切片，片厚5μm，60℃烤片4h，备染。组织切片常规脱蜡入水，新鲜配制的3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，0.02mol／L PBS洗5min×3次；0.01mol／L枸橼酸缓冲液（pH 6.0）微波抗原修复，高火2min，低火12min；滴加兔血清封闭液37℃封闭60min；滴加山羊抗Gas7抗体稀释液中（1∶100）4℃冰箱过夜，复温，0.02mol／L PBS洗5min×3次，滴加HRP标记的兔抗山羊IgG（1∶200），37℃孵育30min，0.02mol／L PBS洗5min×3次；滴加SABC，37℃60min，0.02mol／L PBS洗5min×3次；DAB显色5－30min，蒸馏水洗涤；乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍摄照片。本实验中，用PBS代替一抗作为阴性对照。2张切片／每只大鼠，在400倍视野下测量相同单位面积内阳性产物的平均灰度值。

5.统计学分析

结 果

1.RT－PCR检测Gas7mRNA在大鼠小脑皮质不同发育时期的表达

琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，Gas7mRNA在大鼠小脑皮质不同发育时期均有不同程度的表达。Gas7mRNA在大鼠小脑皮质不同发育时期的表达经β－actin内参校正处理后发现，从E18.5到Adult呈先增强后减弱的趋势，峰值在P21（图2）。

图1 RT－PCR结果琼脂糖凝胶电泳图，显示Gas7mRNA在大鼠小脑皮质发育过程中不同时间点的表达。1.MarkerI；2.Adult；3.P21；4.P14；5.P7；6.P0；7.E20.5；8.E18.5Fig.1Electropherogram of Gas7mRNA expression in the cerebellar cortex of rat during development by RT－PCR on 1.2%agarose gel.1.MarkerI；2.Adult；3.P21；4.P14；5.P7；6.P0；7.E20.5；8.E18.5

图2 Gas7mRNA在大鼠小脑皮质发育过程中不同时间点表达的比较。＊与前一时间点比较P＜0.01。Fig.2Comparison of Gas7mRNA expression in the cerebellar cortex of rat during developpment.＊Compared with former time point，P＜0.01.

2.免疫组化检测Gas7蛋白在大鼠小脑皮质不同发育时期的表达和分布

Gas7蛋白免疫组织化学阳性产物为棕黄色颗粒。Gas7蛋白主要强表达于Purkinje细胞的胞质、胞膜和突起。在E18.5（图3A）和E20.5（图3B）大鼠的小脑皮质开始有较弱的Gas7免疫阳性产物，呈絮状分布在Purkinje细胞层。P0（图3C）在Purkinje细胞层可见到形态不规则的Gas7免疫阳性细胞，轮廓模糊，与其它细胞层相比着色最深，呈明显的带状。P7（图3D）在Purkinje细胞层Gas7阳性细胞轮廓能分辨；内颗粒层出现一些散在的Gas7强阳性细胞，胞体较小，突起清晰可见。P14（图3E）在小脑皮质4层结构中均有Gas7免疫阳性产物分布。外颗粒层可见Gas7免疫阳性神经纤维；分子层可见大量的Gas7免疫阳性产物，主要定位在Purkinje细胞的突起上；Purkinje细胞层Gas7阳性细胞轮廓清晰，胞膜和胞浆着色，胞核不着色；内颗粒层Gas7免疫阳性反应与P7比较增强（P＜0.01）。P21（图3F）外颗粒层消失，整个分子层均有Gas7免疫阳性神经纤维分布，且较P14密集，着色加深，与P14比较免疫反应增强（P＜0.01）；Purkinje细胞层Gas7免疫阳性细胞较P14着色加深，免疫反应增强（P＜0.01）；内颗粒层Gas7免疫阳性细胞消失。与P21相比，Adult（图3G）大鼠小脑皮质各层Gas7免疫阳性反应明显减弱（P＜0.01）。未加一抗的组织切片无阳性产物（图3H）。说明本实验的免疫反应是特异性的。小脑皮质各层不同发育时间点Gas7免疫阳性产物的平均灰度值见表1。

图3 Gas7在大鼠小脑皮质发育过程中不同时间点的表达和分布.SABC法×400。A－G：分别为E18.5，E20.5，P0，P7，P14，P21和Adult时，Gas7在大鼠小脑皮质的表达和分布；H：未加Gas7抗体的成年大鼠小脑皮质切片无免疫阳性产物；AH：标尺＝100μm.Fig.3Expression and distribution of Gas7in the cerebellar cortex of rat during development.SABC immunohistochemical staining×400.A－G：Expression and distribution of Gas7in the cerebellar cortex on E18.5，E20.5，P0，P7 ，P14，P21and A－dult；H：There was no positive immunoreaction in the cerebellar cortex sections of adult rat without Gas7primary antibody；AH：bar＝100μm.

表1 大鼠小脑皮质不同发育时期Gas7免疫阳性产物的平均灰度值（，n＝6）Table 1 The gray value of Gas7positive immunoreaction in the cerebellar cortex of rat during development（，n＝6）

表1 大鼠小脑皮质不同发育时期Gas7免疫阳性产物的平均灰度值（，n＝6）Table 1 The gray value of Gas7positive immunoreaction in the cerebellar cortex of rat during development（，n＝6）

注：EGL：外颗粒细胞层；ML：分子层；PCL：浦肯野细胞层；IGL：内颗粒细胞层；－：未见阳性产物；＊与前一时间点比较P＜0.01EGL：external granular layer；ML：molecular layer；PCL：purkinje cell layer；IGL：internal granular layer；－：no positive product；＊ Compared with former time point，P＜0.01.

Group EGL ML PCL IGL E18.5 － － 171.09±5.76 －E20.5 － － 157.18±7.20＊ －P0 161.71±8.77 － 143.73±14.58＊ －P7 138.89±8.37＊ － 127.39±9.95＊ 140.86±7.81 P14 150.87±7.98＊ 112.93±6.92 109.68±9.52＊ 122.31±5.92＊P21 － 84.15±8.14＊ 86.29±9.99＊ －Adult － 115.13±8.90＊ 110.04±11.28＊ －

讨 论

组织学资料显示，E14.5左右大鼠出现小脑原基，由室管膜层、外套层及边缘层构成，E18.5小脑皮质出现片层化结构，由外向内依次为外颗粒层、分子层、Purkinje细胞层和内颗粒层4层结构，E20.5小脑皮质出现沟回结构，随着发育进行，外颗粒层内细胞分裂增生和神经上皮迁移而逐渐增多，至P7－P10达高峰，由于陆续向内颗粒层迁移至P20消失；在P21大鼠小脑皮质分为分子层、Purkinje细胞层和颗粒层3层结构［11，12］。研究表明，小脑皮质发育的关键时期是胚胎晚期至生后前三周，这一时期小脑皮质内大量的神经元经历了分裂增生、分化、迁移以及凋亡和神经元突触的形成、延伸，在P21左右发育成熟［13］。本实验通过RT－PCR方法发现大鼠小脑皮质的不同发育时期均有Gas7mRNA表达，且从E18.5到成年，表达的量呈现先增加后减少的趋势，最高峰在P21。Gas7在大鼠小脑皮质特异性高表达时期正好与大鼠小脑皮质的形态发生、分化成熟的关键时期相一致，提示Gas7可能参与小脑皮质的发育调控。

Chang等研究发现在大鼠体内Gas7蛋白有三种不同分子量的异构体分别是Gas7a（38kd）、Gas7b（47kd）和 Gas7c（56kd）［14］，在大鼠神经系统中的不同组织表达不同，如在大脑皮层及海马中三种异构体均有表达，而在小脑仅有Gas7a的表达。Gas7a羧基末端有一段氨基酸序列称为“FCH”结构域，含有FCH结构域的蛋白质能参于细胞骨架的装配和重组，进而参与细胞的迁移与分化［15，16］。资料报道，Gas7蛋白是很强的F－actin结合蛋白，它与F－actin直接相互作用，参与微管从片状到管状的形成，并增强微管的聚合，进而参与细胞膜动力学的过程，如细胞形态的改变、膜突起的形成和延伸等［17］。Gas7在N2A细胞的高表达可促进细胞突起的形成，并能促进神经生长因子处理过的PC12细胞向神经元方向的分化，促进其突起的形成［18，19］。这些研究资料显示Gas7参与细胞的分化、迁移以及促进轴突的形成和延伸等过程，在促进和维持神经元的成熟及形态分化方面具有重要的作用。本实验通过免疫组化观察发现，外颗粒层在P0开始出现Gas7免疫阳性产物，P7分布了大量的免疫阳性神经纤维，至P14免疫反应明显减弱，P21消失。这种变化与外颗粒层的形成、生长发育以及消亡相一致；结合Gas7的功能，可推测Gas7对外颗粒层的形成和消亡可能起着重要的调控作用。在E18.5和E20.5小脑皮质各细胞层中，只有Purkinje细胞层分布了Gas7免疫阳性产物，这可能与Purkinje细胞在小脑皮质中较早分化有关。生后Purkinje细胞层Gas7免疫反应逐渐增强至P21达高峰，这与RT－PCR结果相一致。Gas7表达的高峰期P21与Purkinje细胞发育成熟期相一致，结合Gas7的功能，可推测Gas7可促进Purkinje细胞的分化成熟及突触的形成、延伸。Gas7基因在大鼠小脑皮质发育过程中表达的时空特异性与小脑皮质内神经元的发生和成熟相关，提示Gas7在小脑皮质形态形成和功能成熟中可能起到一定的调节作用。

实验还发现，内颗粒层在P7和P14出现了一些散在的Gas7免疫阳性细胞，胞体较小、突起清晰可见。这部分Gas7阳性细胞是神经细胞还是胶质细胞，在小脑皮质发育过程中发挥着怎样的作用，还有待进一步研究。

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