王艺东 杨碧莹 潘经锐 纪 原 彭晴霞

（中山大学孙逸仙纪念医院神经科，广州510120）

小胶质细胞作为中枢神经系统内的免疫细胞，是脑内炎症反应的主要执行者。脑缺血发生后，小胶质细胞被激活。在缺血早期小胶质细胞是促炎因子的主要脑内来源，起神经毒性作用。而在缺血后期，小胶质细胞释放神经保护因子，促进组织修复［1，2］。导致小胶质细胞发挥这种“双刃剑”作用的机制是什么？目前还不清楚。Toll样受体（Tolllike receptors，TLRs）是小胶质细胞对外来刺激产生信号传导的一种很关键的受体蛋白，特别是TLR9具有促炎症和细胞保护两条不同的信号转导通路：⑴通过核因子kappa B（Nuclear factor kappa B，NF－κB）途径，诱导促炎症因子（肿瘤坏死因子TNF－α、白介素IL－1）的产生；⑵通过干扰素调节因子7（Interferon Regulatory Factor 7 ，IRF7）途径，诱导I型干扰素（IFN－β、IFN－α）的产生［3］。因此，我们推测TLR9可能在小胶质细胞的“双刃剑”效应中发挥重要的作用。实验在体外采用氧葡萄糖剥夺－再恢 复 （Oxygen－glucose deprivation／recovery，OGDR）模型模拟脑缺血再灌注的体内过程，用BV－2细胞作为体外研究小胶质细胞的细胞模型，观察OGDR后BV－2细胞TLR9下游信号分子的变化规律，为深入研究TLR9在小胶质细胞的“双刃剑”效应中的作用打下基础。

材料和方法

1.实验材料

小鼠BV－2细胞（中山大学孙逸仙纪念医院唐亚梅馈赠），DMEM／F12培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶购自美国GIBCO公司，WST－8试剂盒购自日本同仁化学研究所，免疫细胞化学试剂盒购自福州迈新公司，大鼠抗小鼠单克隆CD68抗体购自美国ABD公司，TRIzol、逆转录试剂盒、TLR9 PCR引物购自日本 TaKaRa公司，β－actin PCR引物购自上海英潍捷基公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自武汉博士德公司，小鼠TLR9蛋白单克隆抗体购自英国Abcam公司，小鼠NF－κB（P65）蛋白单克隆抗体、磷酸化NF－κB（P－P65）蛋白单克隆抗体、IRF7蛋白单克隆抗体、磷酸化IRF7（P－IRF7）蛋白单克隆抗体购自美国CST公司，小鼠GAPDH蛋白单克隆抗体购自杭州宝科生物公司，PhosSTOP磷酸化酶抑制剂，小鼠IL－1β和TNF－αELISA试剂盒购自美国R＆D公司，小鼠IFN－βELISA试剂盒购自美国Life technology公司。

2.细胞培养

BV－2细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM／F12培养液中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。0.25%胰酶消化传代，3－5d传代一次。至细胞生长良好时开始实验。

3.OGDR模型的建立

先调设三气培养箱至缺氧状态（37℃，1%O2，5%CO2，95%N2）。把 BV－2细胞以合适密度分别接种于6、24、96孔板，吸出培养基，加入EBSS平衡盐溶液，置于缺氧箱内培养。4h后将细胞取出，此时细胞损伤达约30%－40%。换回原培养基，置于普通培养箱（37℃，19%O2，5%CO2）继续培养。根据复氧时间不同，分为0h、6h、12h、24h、48h、72 h组。以常氧培养的BV－2细胞作对照。

4.SP法细胞免疫染色

BV－2细胞悬液接种于预置有消毒盖玻片的六孔培养板中，制作成细胞爬片。细胞予OGDR处理后24h取出培养箱。PBS洗一次，4%多聚甲醛1ml每孔固定10min。将细胞爬片放入0.5%过氧化氢溶液中30min，消除内源性过氧化酶活性。蒸馏水洗3次，滴加山羊血清封闭液，室温下10min，封闭非特异性抗源。甩去山羊血清，滴加大鼠抗小鼠CD68单克隆抗体，孵育1h。PBS洗3次，滴加Supervision过氧化物酶－山羊抗大鼠IgG，置37℃湿盒中30min。PBS洗4次，DAB显色，至显微镜下观察出现棕褐色阳性信号，水洗终止反应。苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，光学树脂封片，镜下观察拍照。BV－2细胞中出现棕褐色粗大颗粒为阳性，反之为阴性。

5.荧光定量PCR检测

按TRIzol操作说明提取总RNA并鉴定，选择纯度及完整性高的RNA用于后续实验。首先将总RNA逆转录为cDNA（37℃，15min；85℃，5s），得到的cDNA用LC480荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR反应。TLR9引物序列为GAGACCCTGGTGTGGAACATC （forward）and ACTGCAGCCTGTACCAGGAG （reverse）。PCR 反应重复 3次。反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃ 20s，95℃0s，65℃15s，95℃0s，共46个循环。

6.Western Blot检测

提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。以GAPDH为内参。8%SDS－PAGE电泳分离蛋白后，电转法将目的蛋白转移到PVDF膜上，脱脂奶粉封闭1h。分别 加 入 一 抗 （NF－κB（P65），NF－κB（P－P65），IRF7，P－IRF7和 GAPDH 一抗稀释倍数均为1∶1000）4°C孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗（1∶5000）室温孵育1h，TBST洗膜三次，化学发光法显色。采用Image J分析软件对目的蛋白条带与GAPDH灰度值的比值进行统计分析。

7.ELISA检测

各组分别在相应时间收集细胞上清液，于－80℃保存备用。分别按照各试剂盒说明检测各样本细胞上清中IL－1β、TNF－α和IFN－β含量，每个样本重复三个复孔，加好终止液后5min内以酶标仪450 nm 测定吸光度，待测样本中IL－1β、TNF－α和IFN－β浓度与OD 450值成正比，通过绘制标准曲线求出各组细胞中IL－1β、TNF－α和IFN－β浓度。

8.统计学分析

结 果

1.免疫细胞化学染色结果

OGDR组BV－2细胞胞体较大，发出多个突起，呈阿米巴样，胞膜和胞浆中可见棕褐色粗大颗粒，呈强阳性染色，其中淡蓝色为细胞核的衬染。说明经OGDR处理BV－2细胞的CD68蛋白阳性表达，即小胶质细胞被激活。对照组中正常BV－2细胞细胞体呈细长或椭圆，发出细长而有分支的突起，只见细胞核的衬染，胞浆及胞膜未见阳性染色（图1）。

图1 BV－2细胞免疫细胞化学染色。A.对照组，BV－2细胞胞浆及胞膜未见阳性染色（×1000）；B.OGDR组，OGDR 24 h BV－2细胞胞膜和胞浆中可见棕褐色粗大颗粒，呈强阳性染色（×1000）。Fig.1CD68immunocytochemical staining of BV－2cell.A.Control group.There was no positive staining in BV－2cell plasma and membrane（×1000）；B.OGDR group.Brown coarse particle appeared in BV－2cell membrane and cytoplasm at 24 hour，showed strong positive staining（×1000）.

2.OGDR后BV－2细胞TLR9mRNA表达的变化

经鉴定，提取的RNA完整性好。对照组各时间点BV－2细胞TLR9mRNA表达差异无统计学意义（F＝0.250，P＝0.932）；OGDR组随着时间延长TLR9mRNA表达逐渐升高，24h达高峰，后表达逐渐降低，但72h仍高于0h时间点，差异有统计学意义（F＝5.400，P＝0.008）。相同时间点比较，OGDR组的TLR9mRNA表达量高于对照组，除0 h外，其他时间点的结果均有统计学意义的差异（P值均＜0.05）（图2）。

3.OGDR后BV－2细胞 NF－κB （P65）、NF－κB（P－P65）、IRF7、P－IRF7蛋白表达的变化

对照组各时间点 BV－2细胞 NF－κB （P65）、NF－κB（P－P65）、IRF7、P－IRF7蛋白表达均无显著差异（P值均＞0.05）。OGDR组各时间点BV－2细胞 NF－κB（P65）和IRF7表达无明显变化（P 值均＞0.05）。与对照组相同时间点比较，OGDR组NF－κB（P－P65）在0h、6h、12h明显增高（P 值均＜0.05），24h、48h、72h表达无明显增高（P 值均＞0.05）；P－IRF7在0h、6h无明显增高，从12h起明显增高（P 值均＜0.05）。P－P65／P65的比值在0h－12h表达增高，而 P－IRF7／IRF7的比值在12h－72h增高（图3、4）。

图2 荧光定量PCR检测BV－2细胞TLR9mRNA的表达。＊与相同时间点对照组比较P＜0.05；＃与OGDR组0 h比较P＜0.05；＆与前一时间点OGDR组比较P＜0.05。Fig.2The expression levels of TLR9mRNA in BV－2 cell were detected by fluorescence quantitative PCR.＊ P＜0.05，vs the control group at the same time；＃ P＜0.05，vs the OGDR group at 0hour；＆P＜0.05，vs the OGDR group at the previous point in time.

图3 Western Blot检测BV－2细胞 NF－κB（P65）、磷酸化 NF－κB（P－P65）蛋白表达。＊ 代表与与相同时间点对照组比较P＜0.05，＆与前一时间点OGDR组比较P＜0.05。Fig.3The expression levels of NF－κB （P65）and phosphorated NF－κB （P－P65）protein in BV－2cell were detected by Western Blot.＊ P＜0.05，vs the control group at the same time；＆P＜0.05，vs the OGDR group at the previous point in time.

4.OGDR 后 BV－2细胞上清中 TNF－α、IL－1β和IFN－β水平的变化

对照组各时间点 BV－2细胞 TNF－α、IL－1β和IFN－β水平均无显著差异（P值均＞0.05）。OGDR组各时间点之间TNF－α、IL－1β表达水平有统计学差异（P 值均＜0.05），IFN－β水平无显著差异（P＞0.05），但在24h、48h、72h与对照组相同时间点比较有统计学意义的增加（P 值均＜0.05）。TNF－α在OGDR后12h明显增高，于24－48h达峰，后下降。IL－1β表达在OGDR后6h明显增高，至48h达峰，后显著下降（表1）。

图4 Western Blot检测BV－2细胞IRF7、磷酸化IRF7（P－IRF7）蛋白表达。＊与相同时间点对照组比较P＜0.05，＃与OGDR组0h比较P＜0.05，＆与前一时间点OGDR组比较P＜0.05。Fig.4The expression levels of IRF7and phosphorated IRF7 （P－IRF7）protein in BV－2cell were detected by Western Blot.＊P＜0.05，vs the control group at the same time；＃P＜0.05，vs the OGDR group at 0hour；＆P＜0.05，vs the OGDR group at the previous point in time.

讨 论

小胶质细胞是中枢神经系统最重要的免疫细胞，在神经胶质细胞中占约20%。作为中枢神经系统常驻的抗原提呈细胞和巨噬细胞，小胶质细胞起着免疫监视的关键作用［4］。小胶质细胞的激活是脑缺血再灌注后炎症反应中最重要的改变之一。在正常情况下，小胶质细胞处于静息状态，脑缺血再灌注后，小胶质细胞迅速被激活，发挥其重要的生物学效应。本研究采用OGDR方法模拟脑缺血再灌注的体内过程，观察到OGDR后存活的小胶质细胞形态发生明显改变，由静止的分枝状变成阿米巴样的激活状态。免疫细胞化学染色证明OGDR后小胶质细胞激活的其中一个标志物CD68染色强阳性。这与Lyons和 Colton等的研究结果［5，6］一致，显示OGDR处理后存活的小胶质细胞被激活。

TLR9是小胶质细胞对外来刺激产生信号传导的重要的受体蛋白，脑缺血再灌注后小胶质细胞的激活与TLR9是否相关，小胶质细胞上TLR9信号通路的表达是否发生改变，还未见文献报道。本研究利用脑缺血再灌注的体外模型，首次观察到小胶质细胞上TLR9信号通路的动态变化，发现OGDR后小胶质细胞上TLR9mRNA表达上调，提示TLR9被激活。

表1 ELISA检测TNF－α、IL－1β和IFN－β表达水平（pg／mL）（），n＝3）Table 1 The expression levels of TNF－α、IL－1βand IFN－βwere determined by ELISA（pg／mL）（），n＝3）

表1 ELISA检测TNF－α、IL－1β和IFN－β表达水平（pg／mL）（），n＝3）Table 1 The expression levels of TNF－α、IL－1βand IFN－βwere determined by ELISA（pg／mL）（），n＝3）

注：与OGDR组0h比较，aP＜0.05，b P＜0.01；与OGDR组6h比较，c P＜0.01；与OGDR组12h比较，d P＜0.01；与OGDR组24h比较，e P＜0.01；与 OGDR组48h比较，f P＜0.01；与对照组相同时间点比较，g P＜0.05，h P＜0.01Note：aP＜0.05and b P＜0.01，vs the OGDR group at 0hour；c P＜0.01，vs the OGDR group at 6hour；d P＜0.01，vs the OGDR group at 12hour；e P＜0.01，vs the OGDR group at 24hour；f P＜0.01，vs the OGDR group at 48hour；g P＜0.05and h P＜0.01，vs the control group at the same time.

Reoxygenation time TNF－α Control group OGDR group IL－1β Control group OGDR group IFN－β Control group OGDR group.23 1.50±0.16 2.42±0.56 6h 31.44±10.70 50.17±12.96 20.13±1.99 43.71±3.10bh 1.77±0.27 2.36±0.45 12h 43.04±12.22 63.66±15.38a 19.42±0.98 42.83±1.87bh 2.09±0.23 2.25±0.61 24h 42.35±11.62 98.87±5.29bcdh 20.85±1.19 55.13±7.49bdh 1.75±0.25 3.02±0.24h 48h 40.46±9.28 94.38±10.67bcdh 22.39±3.30 106.60±12.83bcdeh 1.48±0.21 3.18±0.42h 72h 39.88±4.93 44.70±10.61def 21.04±1.48 23.41±5.12cdef 2.04±0.37 3.26±0.65g Compared with F＝2.245 F＝17.900 F＝1.621 F＝67.120 F＝3.005 F＝2.431 each time point P＝0.117 P＜0.001 P＝0.228 P＜0h 22.65±2.48 32.60±9.11 18.17±2.01 20.70±1 0.001 P＝0.055 P＝0.096

既往研究发现，TLR9的激活导致转录因子NF－κB发生磷酸化并发生核转位，导致一系列基因转录使下游炎症因子TNF－α和IL－1β等表达增多；另一方面，TLR9通过介导IRF7的激活继而导致IFN－α和IFN－β表达增多［3］。本研究也发现OGDR后 TLR9／NF－κB／TNF－α、IL－1β通路的激活，NF－κB（P－P65）0－12h增高，TNF－α逐渐增高，于24－48h达峰，而IL－1β表达在48h达峰。这些结果说明，OGDR后小胶质细胞的激活伴随着TLR9炎症通路的活化。然而，在本实验中我们也观察到，尽管OGDR后磷酸化IRF7表达在12－72h增高，IFN－β在24h、48h、72h与对照组相同时间点比较有明显增加，但没有发现OGDR后各时间点IFN－β有统计学意义的改变，而且IFN－β水平远比 TNF－α、IL－1β水平低。原因可能是IFN－β在72h后才升高，也可能与其他因素有关。Holley等 和Liu等各自的研究均发现TLR2和TLR9可能存在拮抗关系［7，8］。同时给予TLR2和TLR9的激动剂，TLR2的激活可以阻止TLR9活化并诱导I型干扰素表达。而已有研究报道OGDR可以导致TLR2的激活［9］，所以我们推测，以炎症作用为主的TLR2的激活可能抑制了TLR9的细胞保护通路。Coccia等研究发现，给予TLR9特异的配体CpG－DNA刺激，在树突状细胞能诱导所有的IFN－α亚型和IFN－β的表达，而TLR3配体polyI：C和TLR4配体LPS的刺激，在单核细胞来源的树突状细胞却只能诱发IFN－β，而无IFN－α的表达［10］。另一个来自Leung等的研究表明，给予TLR7特异的配体预刺激处理，在小鼠大脑中动脉闭塞模型中检测到脑组织中只有IFN－α的升高而无IFN－β的升高［11］。据此，推测 OGDR后BV－2细胞中只有IRF－7的升高而未见IFN－β的表达增多也可能与细胞的种类以及处理的方式和强度有关。

综上所述，OGDR处理在72h内主要活化小胶质细胞上TLR9的炎症通路。由于OGDR可能同时激活了其他TLRs，不同TLRs之间可能存在复杂的交互作用（Crosstalk）［12］，导致IFN－β的表达受抑制。此外，由于受BV－2细胞株生长速度影响，本实验未能观察OGDR 72h后小胶质细胞TLR9信号通路的激活情况，还需要进一步通过体内实验进行更长时间的研究，以明确TLR9信号通路的激活与小胶质细胞双向作用的相关性。

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