秦燕子 武世伍 马 莉 柴大敏 冯振中 王丹娜 陶仪声

（蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠医学院病理学教研室，安徽233004）

乳腺癌（breast cancer）是女性最常见的恶性肿瘤之一。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤的首位。在我国，乳腺癌的发病率有明显上升趋势，其发病率已跃居女性各种恶性肿瘤之首。据估计，全国每年乳腺癌新发病例19万，严重危害着女性的身体健康［1］。尽管目前关于治疗乳腺癌手段很多，极大的提高了病人的生存率及生存时间，但是其发病机制仍然不清楚。

WISP2是CNN家族的新成员，又称CNN5。CNN家族作为一种细胞间质蛋白，在调节细胞有丝分裂、细胞间黏附、诱导细胞凋亡、产生细胞外基质、抑制生长以及多种细胞的迁移中起着重要的作用［2］。WISP2目前在乳腺癌中的研究较多，但是对乳腺癌发生机制的作用仍是不清。ER、PR是调节性腺组织生长发育的雌激素和孕激素受体，乳腺癌中ER、PR的检测对判定患者的预后、指导临床治疗具有重要意义。HER2是一种细胞来源的癌基因，又称原癌基因，参与细胞生长，分化调节，它的高表达与乳腺癌发生进程呈正相关。ER、PR与HER2蛋白检测已被公认为用于指导乳腺癌患者临床治疗，目前关于乳腺癌分子生物学的研究很多着眼于探讨与这三者之间的关系。本文采用免疫组织化学检测人浸润性乳腺癌组织中WISP2的表达情况，同时检测WISP2和临床病理参数以及与ER、PR、HER2的关系，分析 WISP2对乳腺癌患者预后的影响，探讨它对乳腺癌患者临床治疗的指导意义。

材料和方法

1.临床资料

收集安徽省蚌埠医学院第一附属医院病理科2008年1月－12月浸润性乳腺癌组织蜡块标本87例，乳腺原位癌组织蜡块标本60例，正常乳腺组织蜡块标本20例。所选患者术前均未做放、化疗及内分泌治疗，病理诊断由本院临床病理科两位以上高年资病理医师确诊，同时患者具有完整的临床资料及病理资料，经过蚌埠医学院人体实验伦理道德委员会同意。根据2012年WHO乳腺肿瘤组织学分类，87例浸润性乳腺癌中，年龄24－84岁（平均50岁），≤50岁56例，＞50岁31例；肿瘤部位：左侧40例，右侧47例；肿瘤分化程度：Ⅰ级15例，Ⅱ级43例，Ⅲ级29例；肿瘤直径：≤2cm的41例，2cm＜T≤5cm的42例，＞5 cm的4例；肿瘤分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期43例，Ⅲ12例，Ⅳ8例；淋巴结发生转移者47例，淋巴结未发生转移者40例。

2.免疫组织化学染色

浓缩型WISP2兔抗人多克隆抗体购自美国Abcam公司（稀释比1∶100），即用型兔单抗ER、PR、HER2及DAB显色剂均购自福州迈新公司。免疫组织化学ElivisionTMPlus法，具体步骤按照说明书进行。PBS代替一抗作为阴性对照，用已知的乳腺癌阳性片做阳性对照。主要包括以下步骤：常规脱水、透明石蜡包埋、二甲苯脱蜡水化、过氧化氢阻断、抗原修复、滴一抗、滴增强剂、滴二抗、DAB显色、中性树胶封片。

3.免疫组化结果判定

WISP2蛋白表达于细胞浆，当乳腺癌细胞的胞浆中出现黄色或棕黄色颗粒则提示为阳性。免疫组化结果采用半定量双评分法评价［3］：每张切片随机观察10个高倍视野.每个视野计数200个细胞。阳性细胞记为：＜10%为0分；10%－50%为1分；51%－75%为2分；＞75%为3分；细胞着色强度记为：不着色为0分；浅黄色为1分；黄色为2分；棕褐色为3分.两者相乘作为表达判定性结果，若积分≤1为阴性，＞1为阳性。

ER、PR阳性物质定位于细胞核，细胞核出现黄色或者棕黄色颗粒。任意选取5个高倍视野，计数每个视野中的阳性细胞数，其数所占总细胞数比例的平均值，定义为阳性细胞百分比，以此作为评定依据［4］：阴性（－）为阳性细胞数＜5%或者不着色或者着色细胞数＜10%；弱阳性（＋）为阳性细胞数6%－25%或者着色弱且不连续；阳性（＋＋）为阳性细胞数26%－50%或者着色中等部分不连续；弱阳性（＋＋＋）为阳性细胞数＞50%或者着色强且连续。

HER2蛋白阳性表达于细胞膜，呈黄色及棕黄色颗粒，根据肿瘤细胞膜着色强度和比例来确定，按评分标准［5］：3分为＞30%肿瘤细胞呈强、均一且完整胞膜着色；2分为≥10%肿瘤细胞呈弱或中等完整的包膜着色，或＜30%肿瘤细胞呈现一致的强且完整的包膜着色；1分为任何比例的肿瘤细胞呈弱、不完整的包膜着色或＜10%的肿瘤细胞呈弱、完整包膜着色；0分为肿瘤细胞无着色。本实验采用＞1分为阳性。

4.随访

通过门诊、电话等方式，记录乳腺癌患者总体生存时间（OS，overall survival time，即自患者明确诊断乳腺癌到因该肿瘤所致死亡之间时间），随访截止至2014年1月。

5.统计学分析

采用SPSS19.0软件，运用χ2检验WISP2与浸润性乳腺癌患者临床病理参数，Spearman等级相关分析检测WIPS2与ER、PR、HER2的相关性，Kaplan－Meier法绘制生存曲线，对生存率采用Log－rank进行单因素分析、Cox回归模型多因素分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.WISP2的蛋白表达

WISP2主要表达于乳腺癌细胞的细胞浆（图1）。本例中，WISP2在浸润性乳腺癌中阳性率为75.9%（44／87），在乳腺原位癌阳性率为 86.7%（52／60），在正常乳腺组织中阳性率为10%（2／20），组间比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。87例乳腺癌中，WISP2的蛋白表达水平与组织学分级、淋巴结转移、临床分期、肿瘤大小（P＜0.05）。其中，组织分级Ⅰ级阳性率86.7%，Ⅱ级阳性率为60.5%，Ⅲ级阳性率为17.2%；发生淋巴结转移的阳性率为29.8%，未发生淋巴结转移的阳性率为75.0%；临床分期Ⅰ、Ⅱ期的阳性表达率为59.7%，Ⅲ、Ⅳ的阳性表达率为20.0%；肿瘤直径不大于2cm的阳性表达率为65.9%，直径大于2cm，且不大于5cm的阳性表达率为35.7%，直径大于5cm的阳性表达率为50.0%。见表1。

图1 WISP2在不同乳腺组织中的表达情况 （ElivisionTM）×400）A.在正常乳腺组织在WISP2不表达；B.在乳腺原位癌组织，细胞浆中棕黄色颗粒为WISP2阳性表达（红色箭头所示）；C.在浸润性乳腺癌组织，细胞浆中棕黄色颗粒为WISP2阳性表达（红色箭头所示）Fig.1Expression of WISP2in different breast tissues（ElivisionTM×400）A.Negative staining of WISP2protein was in normal breast tissue；B.Cytoplasm brown particles appeared as the expression of WISP2protein in DICS（red arrow was shown）；C.Cytoplasm brown particles appeared as the expression of WISP2protein in invasive breast cancer（red arrow was shown）

表1 浸润性乳腺癌中WISP2的表达与临床病理因素的关系（n＝87）Table 1 Correlation of WISP2to clinicopathologic characteristics with invasive breast cancer（n＝87）

2.WISP2蛋白与ER、PR及HER2的相关性分析

Spearman等级相关分析：WISP2蛋白阳性表达与ER、PR蛋白阳性表达呈正相关（rs分别为0.527、0.543），差异均有意义（P＜0.05），而与 HER2蛋白表达无相关性（rs＝－0.044.P＞0.05）。

表2 ER、PR及HER2与WISP2在浸润性乳腺癌组织中表达的相关性Table 2 Correlationship of ER、PR、HER2and WISP2with invasive breast cancer

3.Log－rank生存分析

本组87例患者中，截至随访时间结束，总体五年存活率为75.9%（66／87）。Log－rank分析结果显示：浸润性乳腺癌患者预后与患者的年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、HER2蛋白表达差异无关，而与肿瘤的组织分级、淋巴结转移、临床分期、WISP2蛋白、ER蛋白、PR蛋白表达有关（P＜0.05）。单因素分析见表3。其中，WISP2蛋白阳性组的五年生存率为90.0%，阴性组的为60.5%，二者有明显差异（P＜0.05）。WISP2的生存曲线见图3。

表3 浸润性乳腺癌患者生存状态统计及单因素分析结果Table 3 The statistics and univariate analysis of the patients with invasive breast cancer

图2 WISP2蛋白表达阴性和阳性浸润性乳腺癌患者的Kaplan－Meier生存曲线Fig.2Kaplan－Meier survival curves of patients expression and negative of WISP2protein with invasive breast cancer

4.Cox回归多因素生存分析

将肿瘤位置、年龄、肿瘤直径、组织分级、淋巴结有无转移、临床分期、WISP2表达、ER、PR以及HER2引入Cox模型进行多因素分析，筛选出临床分期可以作为乳腺癌患者独立预后因素（P＜0.05），WISP2不能作为乳腺癌患者独立预后因素（P＞0.05）。见表4。

表4 87例浸润性乳腺癌患者COX回归多因素生存分析Table 4 Multivariate survival analysis of 87patients with invasive breast cancer

讨 论

WISP2是由 Pennica［6］等首先发现的，位于20q12－20q13.1。与其它家族成员比较，WISP2包括三个结构区域：类胰岛素生长因子结合蛋白、VW因子C型重复区、血小板反应蛋白1型重复区，而缺乏CT区域［6－8］。本实验中 WISP2在正常乳腺中表达低或不表达，而在乳腺原位癌及浸润性癌中表达，但是在原位癌中的表达高于在浸润性癌的表达，这与Zoubine Z［9］、Asmaa［10］等 研 究 一 致。 有 研 究 学者［11］将 WISP2这种表达方式命名为“低－高－低”的表达模式，说明WISP2在乳腺癌的发生发展中可能存在双向调控作用，并且能够抑制肿瘤细胞由非侵袭性向侵袭性的表型转变。关于机制仍不清楚，有研究发现在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中，WISP2通过胰岛素样生长因子1（ICF－1）信号通路的活性而控制肿瘤细胞的生长［12］。

ER、PR是正常乳腺上皮细胞存在的雌激素受体，当细胞发生癌变时，ER、PR可以保留或消失，如果癌细胞ER、PR表达消失，此时肿瘤生长增殖就不受内分泌激素的调控，称为非激素依赖性乳腺癌，分化程度较低，淋巴结转移的可能性较大，预后较差。反之，乳腺癌表达ER、PR时，说明癌细胞仍保留雌激素依赖性生长的特征，分化程度高，恶性度低，淋巴结转移慢，预后好［13］。HER2是原癌基因，具有酪氨酸激酶活性，可以促进细胞分裂和蛋白水解酶的分泌，使DNA合成增加，癌细胞生长加快，并增强细胞的运动能力，从而促进肿瘤侵袭。该基因过度表达提示乳腺癌患者预后不好［14］。

本次实验研究发现，在87例浸润性乳腺癌患者中，WISP2在ER阳性组的表达率为71.7%，显著高于在ER阴性组的表达率（17.6%），差异呈正相关（rs＝0.527，P＜0.05）。WISP2基因在2000年就被确定为雌激素反应基因，直接受雌二醇的调控，是雌激素作用的早期效应基因之一［15］。WISP2蛋白水平在PR阳性组的乳腺癌组织的表达率（80.0%）高于PR阴性组的表达率（25.5%），二者呈正相关 （rs＝0.543，P＜0.05）。Snigdha Banerijee等［16］发现在乳腺癌中，WISP2也是PR的靶基因，通过PR独立机制来增加WISP2mRNA表达量。而WISP2在HER2阳性组的表达与HER2阴性组无相关性（P＞0.05）。我们推测在乳腺癌发生、发展中，WISP2可能是ER或者PR诱导的早期基因，很可能参与相关的在雌二醇作用下乳腺癌细胞中孕激素调节的级联反应，ER或者PR表达阳性，均可以促进WISP2的表达，但是相互之间的分子机制还不清楚。同时，在乳腺癌中 WISP2的蛋白表达与HER2表达不存在相关性，目前还未见报道。

本次实验中，WISP2的表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移、组织分级有关。乳腺癌分化程度越差，肿瘤分期越高，淋巴结发生转移，WISP2的阳性表达率越低，研究发现，WISP2在非侵袭性乳腺癌细胞MCF－7的表达明显高于在侵袭力强的乳腺癌细胞株 MDAMB231水平［17－18］，随着侵袭力及增殖能力的增强，WISP2的表达逐渐降低［17］。这与本次研究实验一致。

对87例浸润性乳腺癌患者进行随访分析，发现WISP2阳性组的五年生存率高达90%明显高于WISP2阴性组，提示WISP2可能是一个保护基因，它可能起到抑制乳腺癌患者病情进一步恶化的作用。

大量的实验证明，在乳腺癌细胞株 MCF－7中WISP2的过表达不仅与ER、PR表达有关，还可能与内皮生长因 子、IGF1 有关［19、22］，有研究表 明雌激素促进MCF－7细胞中WISP2基因表达增加还受到内源性环磷腺苷应答元件结合蛋白（endogenous CREB－binding Protein ，CBP）和 p21WAF1／CIP1调控［23］。最新研究发现WISP2可能参与乳腺上皮－间质转化，从而促进乳腺细胞株的癌变［24］。总之，目前乳腺癌的发生、发展机制仍然不清，推测 WISP2可能作为早期乳腺癌的监测基因，它的表达水平可以提示乳腺癌的进展程度，可能有助于临床治疗及判断患者预后情况。

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