林巧

（西昌学院，四川西昌615000）

瑞士乳杆菌产生的细菌素的抑菌活性研究

林巧

（西昌学院，四川西昌615000）

主要通过研究对从建昌板鸭发酵过程中分离瑞士乳杆菌产生细菌素的抑菌活性，考察不同温度，不同pH，不同种类酶作用对细菌素抑菌活性的影响。结果证明：蛋白酶能一定程度抑制细菌素的抑菌活性，且胰蛋白酶的抑制程度最强；该细菌素的抑菌活性对温度的耐受力强，即使在100℃处理后仍具有抑菌活性，在-20℃条件下保存时抑菌活性最强；该细菌素pH在1.5～4.0时具有抑菌活性，在pH为1.5时抑菌活性最强。

瑞士乳杆菌；细菌素；抑菌活性

瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）是一类革兰氏阳性、不产生芽孢、接触酶阴性、能利用可发酵糖产生大量乳酸的厌氧或兼性厌氧微生物。属于食品级安全（Generally regarded as safe，GRAS）的微生物，与人类的生活密切相关，它们是人体和动物肠道微生物菌群中的优势种类，具有调节肠道菌群平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，抑制肠道内腐败菌的生长以及腐败产物的形成等作用[1-4]。

瑞士乳杆菌产生细菌素（Bacterioein）是一种杀菌的多肽类活性物质，可以抑制一个广谱的革兰氏阴、阳性菌，尤其是抑制一些腐败菌和病原菌且与鳌合剂结合可以将其活性谱拓宽到革兰氏阴性菌，因而为食品加工和食品保藏提供了一个新方法。如作为一种安全、无毒、天然的食品防腐剂和抗菌添加剂已被多个国家和地区广泛应用在乳制品、罐头食品上。同时，该细菌素在肉制品发酵过程中也被认做为一种抑制有害菌的活性物质。如作为抑制有害菌的有效成分，在建昌板鸭发酵过程中的充分应用[5-8]。

自从瑞士乳杆菌产生的细菌素批准作为食品防腐剂以来，细菌素的研究已成为微生物学研究中的一个活跃领域，研究内容主要涉及细菌素的分离纯化，抑菌活性的影响条件和具体影响趋势，工程菌株的构建以及在肉制品发酵工艺中的应用等。近年来细菌素的研究虽然在分子水平和应用研究上取得巨大进展，但分离纯化率并不理想。

为了更加合理有效地运用细菌素，我们需要对细菌素的一些抑菌性活性进行实验与理论相结合的方法进行分析。这包括了细菌素的pH适应性、热稳定性，不同种类酶影响等方面的研究，收集各种环境下细菌素抑菌圈的大小，从而确定不同环境条件对细菌素抑菌活性的影响程度，为该细菌素在建昌板鸭传统发酵工艺过程中的进一步应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

1.1.1.1 MRS培养基的制作

其配制方法如下：将酵母粉4.0 g，牛肉粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，MnSO40.05 g，吐温80 1.0g，乙酸钠5.0g，MgSO40.2g，KHPO 2.0g，溶于1000mL蒸馏水中，并调节溶液pH为6.1，置于高压灭菌锅中121℃，30min灭菌[9-10]，然后将溶液置于36℃下保存备用。

1.1.1.2 营养琼脂平板的制作

其制作方法如下：将琼脂粉45 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g、溶解于1 000mL蒸馏水中，然后调节溶液pH为7.4，加热溶解，边加热边搅拌，直至溶液中琼脂粉完全溶解为止，然后将溶液置于高压灭菌锅中121℃，30min灭菌，趁热将琼脂溶液以每个20mL置于已灭菌的空白平板内，冷却凝固后得到50个琼脂平板[11-14]。将平板置于36℃下保存备用。

1.1.2 菌种及其来源

瑞士乳杆菌由西昌学院轻化工程学院生物工程实验室从建昌板鸭传统发酵工艺中分离，做生化鉴定，确定种属；大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphy lococcus-aureus）、链球菌（Streptococcus）由西昌市华宁公司动物保健中心提供。

1.1.3 试剂

胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K，溶菌酶，固体硫酸铵，丙酮溶液，乙醇溶液，盐酸溶液，氢氧化钠溶液等。

1.1.4 设备

MJ-250B-Ⅱ微机霉菌培养箱：上海悦丰仪器仪表有限公司；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；不绣钢双层立式电热蒸汽压力消毒器：上海三申医疗器械有限公司；台式离心机：上海安亭科学仪器有限公司；中空纤维滤系统：四川成都爱普科学仪器有限公司；恒温培养振荡器：上海智成仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌素的分离及收集

1.2.1.1 菌种活化

从4℃取出本实验室保存的瑞士乳杆菌菌种，在MRS固体培养基上划线培养，置于培养箱中36℃，24h培养，挑选体积较小、边缘不整齐、中央突起，表面不光滑、成乳黄色的瑞士乳杆菌接种于1 000mL的MRS液体培养基中，置于培养箱中36℃，24 h培养，菌液置于4℃冰箱保存备用。

1.2.1.2 细菌素的分离

将瑞士乳杆菌发酵液于1 000mL、4℃条件下离心30min，去除菌体，经中空纤维超滤系统处理后，收集含有细菌素的上清液于锥形瓶中，4℃振荡过夜。

1.2.1.3 低温有机溶剂萃取

上清液用中空纤维滤系统处理后，分装在5个锥形瓶中，分别加入等体积丙酮，4℃下沉淀，过滤，沉淀分别用90%乙醇溶液100mL洗涤3次以除去残留的丙酮。沉淀用500mL蒸馏水溶解于烧杯中，得到溶液。

1.2.1.4 硫酸铵梯度沉淀

将上一步所得溶液经中空纤维滤系统处理后，收集于已称重的烧杯中，取500 g溶液，加入固体硫酸铵配置成45%硫酸铵饱和液，4℃振荡过夜。然后在已形成沉淀的饱和液中加入固体硫酸铵，使溶液饱和度由45%上升至60%，4℃振荡过夜。过夜后再向60%硫酸铵饱和液中加入固体硫酸铵，使硫酸铵溶液饱和度由60%上升至80%，4℃振荡过夜[15]。

1.2.1.5 细菌素的收集

过夜后的80%硫酸铵饱和液经500 g，4℃，2 500 r/min条件下离心30min，过滤，收集沉淀，分别用90%乙醇溶液100mL洗涤沉淀3次，以除去沉淀上的杂质以及残留的硫酸铵，再将沉淀用蒸馏水溶解，经800mL，4℃条件下离心30min，去除沉淀，收集上清液，经中空纤维滤系统处理后，收集500mL溶液于锥形瓶中，得到含有细菌素的上清液。

1.2.1.6 细菌素的分离鉴定

采用Sephacryl S-100HR填料柱在Purifier100蛋白质纯化系统上进行凝胶过滤，收集有抑菌活性的组分，做酸排除试验，之后采用HPLC检测该组分的纯度，确定得到的蛋白类活性物质为细菌素。

1.2.1.7 细菌素抑菌试验指示菌平板的制作

分别取8mL培养好的大肠杆菌菌液、金黄色葡萄球菌菌液、链球菌菌液，用脱脂棉均匀涂抹到已得到的琼脂平板上，待菌液完全渗入琼脂平板后，分别得到大肠杆菌指示平板，金黄色葡萄球菌指示平板，链球菌指示平板，为细菌素的抑菌试验做准备。

1.2.2 细菌素的抑菌试验

取2个大肠杆菌指示平板，用无菌镊子分别取3个牛津杯贴放于平板表面，各牛津杯对称放置，相邻杯中心之间相距25mm以上，各杯与平板的周缘相距15mm以上。放好后，用无菌镊子轻压牛津杯，使其紧贴于平板底端，向1个大肠杆菌指示平板的牛津杯中分别加入不同因素处理后的细菌素溶液0.5mL，盖好平皿，在另外1个大肠杆菌指示平板的中分别加入经37℃，24 h培养后未经处理的细菌素溶液0.5mL以形成对照试验，做以大肠杆菌为指示菌的牛津杯对照试验[17-20]。采用同样的方法，对细菌素分别作以金黄色葡萄球菌，链球菌为指示菌的牛津杯对照试验，选取均匀而完全生长的抑菌圈，用数显游标卡尺测量各条件下细菌素抑菌圈的直径，并记录测量数据。

1.3 细菌素抑菌活性的研究

1.3.1 不同温度对细菌素的抑菌圈影响试验

将瑞士乳杆菌产生的细菌素溶液，分别在-20、4、37、60、90、100℃下处理60min后，待细菌素恢复至室温，对细菌素分别做以大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，链球菌为指示菌的牛津杯试验，测量并记录各个温度下细菌素的抑菌圈直径。

1.3.2 不同pH对细菌素的抑菌圈影响试验

取细菌素溶液，用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节细菌素溶液的pH分别为1.5、2.5、3.0、4.0、5.0、8.0，以未经过pH处理的细菌素溶液为对照，将各细菌素溶液置于恒温培养箱中37℃，24 h培养。对细菌素分别做以大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，链球菌为指示菌的牛津杯对照试验，测量并记录各条件下细菌素的抑菌圈直径。

1.3.3 不同酶处理对细菌素的抑菌圈影响试验

1.3.3.1 酶液的配制

分别取20mg酶加入到20mL灭菌过的无菌双蒸水中，配制成1mg/mL的酶溶液，用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节胰蛋白酶溶液，胃蛋白酶溶液、蛋白酶K溶液、溶菌酶溶液的H值至最佳酶活力，其pH分别为5.1、2.0、7.5、5.0，将所得的酶溶液置于-20℃下保存备用。

1.3.3.2 酶反应试验

将细菌素溶液分别与4种酶溶液等体积混合，以加入相应pH的等体积无菌水的细菌素溶液为对照，置于37下反应30min，对细菌素分别做以大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，链球菌为指示菌的牛津杯对照试验，测量并记录各条件下细菌素抑菌圈的直径。

2 结果与分析

2.1 不同温度对细菌素的抑菌圈的影响试验结果

对瑞士乳杆菌产生的细菌素溶液在不同温度下处理60min后，待细菌素溶液恢复至室温，对细菌素分别做以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌为指示菌的牛津杯试验，确定不同温度引起的细菌素溶液的抑菌圈直径的变化方向及强弱，结果如表1所示。

表1 不同温度处理的细菌素的抑菌圈直径Table1 Bacteriocin inhibition zone diameter at different temperatures mm

由表1的结果看出，随着温度的增高，瑞士乳杆菌产生的细菌素的抑菌圈直径变小。这表明瑞士乳杆菌产生的细菌素的抑菌活性有一定下降；但该细菌素溶液在100℃下处理60min后仍具有较强的抑菌活性，这证明该细菌素对温度的耐受力强，具有良好的热稳定性。导致这种结果的根本原因是瑞士乳杆菌产生的细菌素属于小分子热稳定性疏水肽类活性物质，随着温度升高，该细菌素的热稳定性逐渐减弱，且这种活性物质可耐受至100℃的高温。该细菌素在-20℃下保存抑菌活性最强，这证明低温环境有利于该细菌素的保存。

2.2 不同pH对细菌素的抑菌圈的影响试验结果

对瑞士乳杆菌产生的细菌素溶液做不同pH处理，以未处理的细菌素溶液做对照，将细菌素溶液置于培养中37℃，24 h培养后，对细菌素溶液分别做以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌为指示菌的牛津杯对照实验，确定不同pH处理引起的该细菌素的抑菌圈直径的变化方向及强弱，结果如表2所示。

表2 不同pH处理的细菌素的抑菌圈直径Table2 Different pH value of the meat processing bacteria bacteriostatic circledia meter mm

表2表明，该细菌素的抑菌圈直径随着pH的增大而变小，这是由于瑞士乳杆菌产生的细菌素分子量较小，且该细菌素具有嗜酸性而导致的结果。这说明该细菌素的抑菌活性随pH的增高而降低。该细菌素在pH1.5～4.0时具有抑菌活性，且酸性越高，该细菌素抑菌效果越强。且在pH为1.5时，抑菌活性效果最强。

2.3 不同酶处理对细菌素的抑菌圈的影响试验结果

将瑞士乳杆菌产生的细菌素溶液分别与4种酶溶液等体积混合，置于37℃下反应30min，以未经过酶处理的细菌素溶液做对照，对细菌素分别做以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌为指示菌的牛津杯对照试验，确定4种酶处理后引起的细菌素溶液的抑菌圈直径的变化方向及强弱，结果如表3所示。

表3 不同酶处理的细菌素的抑菌圈直径Table3 Bacteriocin inhibition zone diameter of the different enzyme treatment mm

表3表明，瑞士乳杆菌产生的细菌素溶液在4中不同酶处理后，抑菌圈直径都有一定下降，尤其是胰蛋白酶处理后，该细菌素的抑菌圈直径下降特别明显。这说明4种酶均能在一定程度上减弱该细菌的抑菌活性。其中，胰蛋白酶对细菌素的抑菌活性的减弱影响最强，而溶菌酶对该细菌素的抑菌活性的减弱影响最弱。导致这种结果的根本原因是瑞士乳杆菌产生的细菌素属于小分子多肽类物质，而蛋白酶类均能分解该细菌素，从而使该细菌素的抑菌圈直径变小，抑菌活性减弱。其中，胰蛋白酶分解该细菌素的能力最强，溶菌酶分解该细菌素的能力最弱。

3 结论

本试验证明，瑞士乳杆菌产生的细菌素随着环境温度的升高，其抑菌活性逐渐减弱，所以在建昌板鸭发酵工艺中，低温发酵可更有效的保持细菌素的抑菌活性。该细菌素的抑菌活性随pH升高而减弱，随着建昌板鸭发酵工艺的进行，乳酸菌和酵母菌的数量增加，使pH降低，而低pH的环境有利于细菌素发挥对有害菌的抑制作用。四种酶均能减弱该细菌素的抑菌活性，所以在建昌板鸭发酵工艺中，可加入抑制酶类作用的活性物质，从而更有效的维持或增强细菌素的抑菌活性。

本实验最终得到了不同温度、不同pH、不同酶处理引起的建昌板鸭中分离的瑞士乳杆菌产生的细菌的抑菌活性的抑菌活性的具体变化，为当地板鸭的规模化生产和细菌素在发酵工艺中的进一步应用提供科学理论依据和实验基础。

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Bacteriocin Antibacterial Activity Produced by Lactobacillus helveticus Isolated Jianchang Dry-cured Duck

LIN Qiao
（Xichang College，Xichang 615000，Sichuan，China）

The antibacterial activity of this experiment by studying bacteriocins produced by Lactobacillus helveticus was investigated at different temperatures，different pH，different types of enzymes on the antibacterial activity of bacteriocin.Results showed that：proteinase can be a certain extent the antibacterial activity of bacteriocin，trypsin inhibition of the strongest；the antibacterial activity of the bacteriocin on the temperature tolerance and strong，even after treated at 100℃ has antibacterial activity，the st rongest antibacterial activity when stored at-20℃；the bacterial factors pH of1.5 to 4.0 with antibacterial activity and antibacterial activity of the strongest at pH 1.5.

Lactobacillus helveticus；Bacterioein；Antibacterial activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.029

2014-01-10

四川省教育厅科研基金项目（09ZC005）

林巧（1978—），女（汉），副教授，硕士，主要从事食品生物技术与微生物研究。