宫颈癌分子遗传机制及其相关基因功能研究

张怀念，张咏莉

(广东药学院，广东 广州510006)

摘要:宫颈癌是妇科中最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率在女性恶性肿瘤中位居第二，仅次于乳腺癌。目前宫颈癌的治疗效果并不佳，并且其具体的致病机制尚不清楚。为了阐述对宫颈癌预防及治疗有意义的新的靶点，该文主要从分子水平综述其相关致病机制及其涉及到的相关基因。目前研究比较新的宫颈癌发病机制涉及有微小RNA(mi RNA)，DNA甲基化等方面，这些基因靶点在宫颈癌的发生、发展、诊断、治疗及预后等各个环节中起到关键作用。

关键词:宫颈癌；致病机制；相关基因；微小RNA；DNA甲基化

宫颈癌是全球女性中最为常见的恶性肿瘤之一，其严重的影响到了妇女的生命活动[1-2]。在中国，每年大约有13.5万新病例和8万人由于宫颈癌疾病而死亡，此外，在年轻的中国女性中(小于30岁)，宫颈癌的发病率以每年2%~3%持续增加[3]。虽然人类乳头瘤病毒(HPV)被认为是宫颈癌的主要致病因素，然而，病毒感染本身不足引起癌症的发生。宫颈癌的发病机制尤为复杂，对女性危害极为严重，因此准确地了解宫颈癌致病的分子机制，对宫颈癌预防、治疗是必不可少的[4]。近些年来，mi RNA、DNA甲基化等在宫颈癌发病中的作用成为关注的热点，因此，本文就其二者在宫颈癌发病中的研究现状加以综述。

1mi RNA在宫颈癌致病机制研究中的应用和进展

1.1mi RNA概述mi RNA是在真核细胞中发现的一种内源性的起着调控作用的单链非编码 RNA，长约22～25个核苷酸。由内含子中的mi RNA转录形成原始的mi RNA，经过一系列剪切加工成成熟的 mi RNA，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，再通过碱基互补配对的方式与靶m RNA 结合，最终参与基因转录后表达调控。相关研究表明，50%以上mi RNA基因定位于基因脆性位点或肿瘤相关基因组区域，mi RNA通过促使靶m RNA降解或抑制其翻译来调节靶基因的表达，在细胞的分化、增殖、凋亡、机体代谢以及肿瘤的发生、转移过程中发挥着重要作用[5]。鉴于一些mi RNA基因可以通过调节表观遗传机制的，提出了mi RNA的启动子的甲基化状态改变，引起mi RNA的异常表达可能是宫颈癌的一种致病机制[6]。 因此，mi RNA在宫颈癌组织中的表达上调或下调，可能在宫颈癌的致病机制中起着致癌基因或者抑癌基因的作用。

1.2mi RNA在宫颈癌中的检测技术Micro RNA是一种约22个核苷酸长度的内源性RNA碱基对，参与蛋白质的编码，并引导这些mRNA的转录后抑制[7]。目前在宫颈癌研究中，常用于miRNA检测的方法主要有miRNA分子克隆和测序、RNA 印迹技术、引物延伸基因芯片以及实时定量反转录聚合酶链反应(q RT-PCR)等。当前宫颈癌研究中应用最广泛的是借助基因芯片技术进行miRNA 检测，然后利用q RT-PCR验证芯片研究的结果。此外，随着研究技术的发展，原位杂交技术也逐步应用于mi RNA在宫颈癌中的检测。

1.3mi RNA在宫颈癌发病机制中相关基因的研究Tao Tang[8]等采用TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，通过聚类分析的方法在宫颈癌的mi RNA表达谱中，发现了2个上调(mi R- 182 and 183 )和9个下调(mi R-211,145,223,150,142-5p,328,195,199b,142-3p)mi RNA，并通过原位杂交、Western blot、流式细胞仪等技术最终筛选出mi RNA-182，并证实了最上调的mi RNA-182在宫颈癌中表达显著升高，并发现了mi R-182与宫颈癌晚期的表达增加显著相关，并且mi R-182在宫颈癌细胞系中与细胞凋亡和细胞周期信号通路有关。最终结果表明mi R-182起着致癌作用，其发病机制与破坏宫颈癌细胞增殖有关。盖红霞[9]等通过实时荧光定量PCR技术检测mi R-218的相对表达量，初步探讨其表达与宫颈癌发生的关系。结果表明，宫颈癌组织的 mi R-218表达量相对正常宫颈组织有所下降。因此mi R-218表达水平下调与宫颈癌的发生、发展 、转移和侵袭等有关，为宫颈癌的治疗提供了新靶点，并可能作为其治疗及预后评价的一个重要参考指标。韦丽娅[10]等通过基因芯片技术筛选出上调基因mi R-205，对miRNA上调表达的HeLa细胞基因的表达谱进行分析，结果发现在mi R-205上调表达的HeLa细胞中有差异表达的基因共 172 条，其中34条上调，138条下调。因此应用基因芯片技术可以有效的筛查出 mi R-205 上调表达后，在宫颈癌细胞株中存在差异表达的基因，并且mi R-205 引发宫颈癌疾病是由多因素多基因共同作用的结果。Y Shen[11]等应用基因芯片技术筛选出异常表达的mi R-375基因，并利用q RT-PCR等技术，最终发现在紫杉醇治疗宫颈癌时mi R-375表达升高。因此，mi R-375基因可能作为紫杉醇治疗宫颈癌时的有一个有效治疗靶点。

2DNA甲基化在宫颈癌致病机制研究中的应用和进展

2.1DNA甲基化概述DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的催化下，选择性的将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基团结合到Cp G二核苷酸的胞嘧啶上，形成5’-甲基胞嘧啶的过程。其中DNA甲基化主要发生在Cp G二核苷酸位点。甲基化状态的改变是引起肿瘤发生的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平的降低和 5'-GC-3'核苷酸岛局部甲基化水平的异常升高，导致基因组的不稳定从而诱发细胞癌变。其异常高甲基化所致抑癌基因转录失活以及异常低甲基化所致原癌基因激活已经成为肿瘤研究的热点[12]。

近些年，国内外对宫颈癌的DNA甲基化研究逐渐增多，在宫颈癌研究中发现，有多种基因发生了甲基化，并且这种遗传学的改变与宫颈癌的发生有很大的关联性，以下对一些可能与宫颈癌发生、发展密切相关的基因加以总结。(1)上皮型钙黏素(CDH1、CDH13)基因是一种抑癌基因。上皮型钙黏素是重要的细胞间黏附分子，其在维持细胞形态和结构完整性上起着重要的作用，其基因的失活则会导致细胞间的黏附力降低，这与肿瘤的浸润和转移密切相关。其中CDH1甲基化可能导致E-钙黏蛋白表达下调或无表达，CDH13则参与细胞黏附和转移过程，其异常甲基化会引起钙介导的细胞黏附系统失活，此基因可作为一种潜在的评估发生宫颈癌风险的生物标志物；(2)死亡相关蛋白激酶(DAPK1)[13]是一种促凋亡的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该基因是一个参与多种细胞死亡相关信号通路相关联的抑癌基因，此外，其还参与调节细胞自噬。目前也有大量研究发现DAPK1的基因启动子的变异性高度甲基化的改变，发生在多种肿瘤中。DAPK1 启动子 Cp G 岛甲基化可导致基因的失活，并可能参与宫颈癌的发生和发展；(3)Ras相关区域家族(1A RASSF1A)是一种肿瘤抑制基因，该基因丢失及表达改变与多种癌症的发病机制相关，可能是通过影响细胞周期发展、促进细胞凋亡及抗微管解聚等发挥抑制肿瘤细胞生长及转移的作用。由于甲基化的 RASSF1A 基因不能正常表达，从而失去了对细胞的正常生长调节作用，使细胞发生恶变，进而癌变成为恶性肿瘤，是宫颈癌发病机制之一。RASSF1A基因的Cp G岛启动子区域的超甲基化与该基因失活有关，该基因编码的蛋白与诱导细胞周期阻滞有关；(4)CADM1A是一种位于人类染色体11q23.2中的肿瘤抑制基因，其参与细胞骨架构建和维持细胞的黏附功能的稳定，当CADM1A基因启动子的变异性高度甲基化时会引起肿瘤转移和侵袭；(5)维甲酸受体 -β(RAR-β)属于核转录调节剂甲状腺激素受体超家族中一员，通过调节基因的表达，限制多种类型细胞生长。有关研究表明RAR-β的甲基化程度随着宫颈病变的严重程度而上升；(6)P16INK4a(CDKN2a)基因又称多瘤抑制因子，是一种参与细胞周期调控的抑癌基因，其编码的蛋白为CDK4的抑制剂。其产物P16INK4a蛋白通过与细胞周期素D(cyclin D)竞争性地结合周期蛋白依赖性激酶(CDK4和CDK6)，并特异性抑制CDK4和CDK6激酶的活性，阻止细胞由G1期进入S期，抑制细胞过度增殖，从而抑制肿瘤的发展，是细胞周期调控与癌症关系中最直接联系的一种肿瘤抑制蛋白。相关研究表明P16INK4a启动子区甲基化是P16INK4a基因失活的原因之一，且其表达和宫颈癌的发展及预后密切相关；(7)SOX1(性别决定性基因)编码SOX家族转录因子之一，参与调节胚胎发育和决定细胞存亡。有关研究表明，SOX1基因在宫颈癌组织中甲基化频率高于正常宫颈组织，并且差异有显著性[14-15]。

2.2DNA甲基化在宫颈癌研究中的检测方法目前，在宫颈癌研究中，DNA甲基化的检测方法主要分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。常用的方法主要有甲基化特异性聚合酶链反应法(MS-PCR)、亚硫酸氢钠-限制性酶切法的引物设计、Souther印迹法、实时荧光PCR法、DNA序列法、亚硫酸氢钠-测序法等[16-17]。

2.3DNA甲基化在宫颈癌发病机制中相关基因的研究姚红霞[18]等采用甲基化特异性PCR法和免疫组化法检测正常宫颈组织和宫颈癌组织中p16基因甲基化的发生率以及p16蛋白表达的缺失率，结果发现在正常宫颈组织中没有检测到p16基因甲基化，但是在宫颈癌组织中检测到，并且p16基因的甲基化发生率与宫颈癌的癌变程度成正相关，提示p16基因甲基化与宫颈癌疾病的发生具有相关性。巫剑红[19]等应用Cp G岛富集化分析甲基化芯片(MIRA)技术，从正常组织和宫颈癌组织中筛选出异常表达的甲基化基因，并选取其中甲基化水平较高的性别决定性基因9(SOX9)，接着用亚硫酸氢钠-限制性酶切法检测正常宫颈脱落细胞和宫颈癌脱落细胞中的SOX9的甲基化状态。最终结果表明，SOX9在宫颈癌组织中频繁发生甲基化，并且其甲基化水平显著高于正常宫颈组织，因此SOX9可能作为检测宫颈癌的一种分子标志。张惠娇[20]等采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)测定宫颈鳞癌(CSCC组)、宫颈上皮内瘤变(CIN组)和正常宫颈组织(对照组)中的RUNX3基因甲基化的状态，结果在CSCC组和CIN组中检测出RUNX3基因启动子发生了甲基化，而对照组未检测出，因此RUNX3可作为抑癌基因参与宫颈鳞癌的发生和发展，也可作为对宫颈鳞癌患者进行预后评估的生物学指标。Lin等[21]采用在宫颈癌细胞系中诱导性别决定性基因1(SOX1)过表达，对小白鼠进行体外实验构建动物模型。结果发现过表达的SOX1可以抑制宫颈癌细胞(HeLa，CaSki)的增殖，其中SOX1可以抑制TCF依赖性转录活性和Wnt靶基因，同时还通过调节侵袭相关基因的表达抑制其侵袭。因此SOX1可以通过宫颈癌中Wnt或β-catenin的信号干扰作为肿瘤的一个抑制基因。

3展望

宫颈癌是影响女性生殖器官最为常见的癌症之一，它在所有癌症总体中位列第七，在女性癌症中位居第二。在发展中国家，宫颈癌通常在女性癌症中最常见，大约占据女性癌症的25%。相信随着分子生物学相关技术的快速发展和mi RNA、DNA甲基化等方面基因作用机制的深入研究，基因治疗技术的不断提高，我们将会更清楚地了解宫颈癌的发病原因、致病机制，为宫颈癌的诊断和治疗提供新的依据和方法。同时有望对宫颈癌的病程进展和治疗愈后在基因和分子水平上作更进一步的深入研究,对宫颈癌早期诊断、早期治疗、延长宫颈癌患者的生存时间和提高宫颈癌病人的生活质量具有重要的意义。

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(收稿日期：2014-07-07，修回日期：2014-07-28)◇药学研究◇

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.004

通信作者：张咏莉，女，教授，研究方向：中药材抗肿瘤药效及分子机制，E-mail：zyl5198@163.com

作者简介：张怀念，男，硕士研究生

基金项目：广东省人口计生委科研项目(No 2012334)