方 庆，王成业，姚 瑶，王满媛，许 钒

(1.安徽中医药大学，安徽合肥 230012;2.安徽中医药大学研究生部，安徽合肥 230038;3.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051)

肝脏是人体代谢的中枢器官，起着调节能量、蛋白质、氨基酸等代谢重要作用。肝硬化是由一种或多种病因长期、反复刺激而引起的慢性肝病，肝硬化早期肝脏处于代偿期，而腹水则是肝硬化由代偿期向失偿期进展的重要标志之一。肝硬化腹水是威胁人类健康的常见疾病，目前尚没有理想的治疗方式。肝硬化腹水动物模型的建立是肝病研究中重要一环，建立理想的肝硬化腹水动物模型不仅是进行此类疾病实验研究的基础，也是临床评价肝硬化腹水诊断和治疗方法的有效手段之一［1－5］。

理想的肝硬化动物模型应具备如下条件:与人类肝硬化、门脉高压的特征相同、造模成功率高、死亡率低、周期短、方法简便易行、所用造模因素对人体无害或较少危害，环境污染小等。目前，复制肝硬化腹水动物模型的方法主要有:CCl4法、乙醇法、免疫法、胆管结扎法、复合造模法等。无论是单因素法还是复合因素造模法，复制稳定、成功率高的动物模型仍存在一定的难度。

综合相关文献［6－7］及前期预实验对造模方法的摸索，本研究采用苯巴比妥联合CCl4法复制肝硬化腹水大鼠模型。35%苯巴比妥溶液诱导1周，激活肝脏肝药酶P450活性，第2周开始，按梯度腹腔注射CCl4油溶液，每周2次至第14周。实验进行至中后期，收集大鼠24 h尿液，测量尿量;检查腹腔积液量;肝组织HE染色观察肝脏病理进程。

1 材料与试剂

1.1 动物 SD大鼠，雄性，SPF级，体重(200±20)g，由江苏南京青龙山动物繁殖场提供，合格证号:SCXK(苏)2009－0001。

1.2 试剂 CCl4(分析纯):江苏强盛化工有限公司(批号2008121);福临门一级菜籽油:中粮东海粮油工业有限公司(批号20111010);甲醛(分析纯):上海中试化工总公司(批号20100130);苯巴比妥片:上海信宜药厂有限公司(国药准字H31022038);无水乙醚(分析纯)，上海中试化工总公司批号(20101010)。

1.3 仪器 MP6001电子天平(上海恒平科学仪器有限公司产品);岛津全自动生化分析仪(Olympus，Japan);移液器(Eppendorf);HH.B11.260－TBS台式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);TB－718生物组织自动包埋机(湖北孝感市泰维电子有限公司);LEICA RM2135封闭式切片机(湖北孝感市泰维电子有限公司);TK－218Ⅱ恒温摊片、烤片机(湖北孝感市泰维电子有限公司);DP70数码照相装置(Olympus，Japan)。

1.3 溶液的配制

1.3.1 35%苯巴比妥CMC-Na混悬液配制 精密称取50.0 g CMC-Na粉末，散入盛有蒸馏水的塑料水桶，边加边搅拌，加蒸馏水至10 L，室温放置过夜，即得0.5%CMC-Na混悬液。

精密称取10片(每片30 mg)苯巴比妥片，得平均片重0.066 56 g。取适量苯巴比妥片，研碎，称7.765 3 g药粉。将药粉加入预先配制的 10 L 0.5%CMC-Na混悬液中，搅拌混匀，即得35%苯巴比妥CMC－Na混悬液。

1.3.2 CCl4油溶液的制备 CCl4油溶液的制备:移液器分别取 CCl41.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL加入菜籽油定容至10 mL即得。

1.4 动物模型的建立 大鼠适应性喂养1周后，除正常组给予蒸馏水作为饮用水外，其他各组大鼠第1周给予35%苯巴比妥CMC-Na混悬液(35 mg/100 mL)作为饮用水诱导1周。第2～3周腹腔注射10%CCl4油溶液，每周2次，剂量为0.1 mL/100 g，首次剂量加倍。第4～5周给予12%CCl4油溶液;第6～7周给予14%CCl4油溶液;第8～9周给予16%CCl4油溶液;第10～11周给予18%CCl4油溶液;第12～14周给予20%CCl4油溶液。从第四周开始，每隔2周，取2～3只动物，对肝脏进行病理检测，观察造模过程肝脏病理动态变化。

1.5 成模标准 (1)尿量明显减少且与正常组相比差异有显著性;(2)腹腔积液量增高，差异有统计学意义;(3)肝脏肉眼观察见再生结节，肝脏组织切片观察汇管区—汇管区或汇管区—中央静脉纤维间隔互相扩展和连接，分割肝小叶形成假小叶。

1.6 考察指标 (1)24 h尿量:将大鼠置于代谢笼内，适应饲养2 d后，收集大鼠24 h尿液，测量24 h尿量;(2)腹腔积液量:参考文献方法［8］，于第14周末，大鼠经乙醚麻醉后，沿腹中线剪开3.0 cm，将规格为2.5 cm ×5.0 cm已称重滤纸迅速塞入腹腔，3 min后滤纸充分吸收腹腔积液，取出，称滤纸重，以两次称量之差计为腹腔积液重量。

1.7 肝组织HE染色 (1)取材:大鼠乙醚麻醉后，打开腹腔，从同叶肝脏剪取一块大小为2.0 cm×2.0 cm ×0.5 cm的组织;(2)固定:将取下的肝、肾组织分别置10%福尔马林溶液。脱水透明:将组织依次放入75%乙醇(1.5 h)→ 85%乙醇(1.5 h)→ 95%乙醇(2.5 h)→ 无水乙醇 I(30 min)→ 无水乙醇Ⅱ(30 min)→ 二甲苯I(15 min)→二甲苯Ⅱ(观察至透明即可);(3)浸蜡包埋:将熔化的石蜡倾入包埋模具中，将组织埋入溶化的石蜡中，包埋模具放置在冷水中加速凝固，待石蜡凝固后，取出包埋蜡块，修整成规则的正方型或长方型。用石蜡切片机切片，厚度为4～6 μm。(4)脱蜡:载玻片浸入二甲苯I(10 min)→ 二甲苯Ⅱ(10 min)→二甲苯Ⅲ(10 min)→ 无水乙醇(2 min)→95%乙醇(2 min)→80%乙醇(2 min)→ 自来水冲洗;(5)染色:苏木精浸染(5 min)→ 自来水洗→1%盐酸乙醇分化数秒 → 自来水洗→PBS蓝化(2 min)→自来水洗→伊红(1 min)→ 自来水洗;(6)脱水、透明:95%乙醇(1 min)→ 100%乙醇 I(1 min)→100%乙醇Ⅱ(3 min)→二甲苯I(5 min)→二甲苯Ⅱ(5 min)→二甲苯Ⅲ(5 min);(7)封片:在载玻片上加1～2滴中性树胶，加盖玻片封固，置于通风橱内室温干燥。待载玻片晾干后，于光学显微镜下观察并摄相。

1.8 统计学分析 数据采用统计学软件SPSS 11.0进行分析，结果以“均数+标准差±s)”表示，组间比较采用ANOVA分析。方差齐性，使用LSD法进行比较。P＜0.05为差异具有统计学意义，P＜0.01为差异有显著性。

2 结果

模型组40只SD大鼠肝硬化模型诱导14周共死亡4只，死亡率10.0%。模型组大鼠24 h尿量较正常组明显减少;腹腔积液量显著增多(见表1);病理HE染色结果显示，模型组肝组织出现大量变性、坏死、形成纤维间隔，正常肝小叶被分割形成假小叶。HE染色表明，模型组大鼠肝硬化模型形成;尿量减少，腹腔积液增多，表明模型大鼠腹水形成，即肝硬化腹水模型复制成功。

表1 大鼠24 h尿量、腹腔积液量± s，n=10)

表1 大鼠24 h尿量、腹腔积液量± s，n=10)

注:与正常组比较1)P ＜ 0.05，2)P ＜ 0.01。

/g正常组组别 24 h尿量/mL 腹腔积液量25.38 ±6.19 0.2544 ±0.0577模型组 16.70 ±4.582) 0.3709 ±0.13481)

3 讨论

肝硬化是一种常见的慢性肝病，可由一种或多种原因引起肝脏损害，组织学上表现为肝细胞弥漫性变性坏死，继而出现纤维组织增生和肝细胞结节状再生，这三种改变反复交错进行，结果肝小叶结构和血液循环途径逐渐被改建，使肝变形变硬而导致肝硬化，肝硬化腹水是其失偿代谢期常见临床表现之一，建立适合的肝硬化动物模型，是进行实验研究的基础。

苯巴比妥是典型的肝药酶诱导剂，通过诱导肝药酶P450等药物代谢酶，提高肝脏的物质代谢功能，可加促外源性物质如药物和内源性物质如NH3的生物转化。

CCl4是广泛用于建立肝硬化动物模型的化学诱导剂，其特点为成模率高，重复性好，方法较为简单。其作用机制为CCl4经肝门静脉进入肝脏，随血液循环自汇管区流向中央静脉区。在这此过程中，肝细胞吸收CCl4，肝细胞微粒体细胞色素氧化酶P450被激活生成大量活性三氯甲基(CCl3－)，该自由基通过攻击肝细胞膜的磷脂，导致脂质过氧化，进而破坏细胞膜的结构。另外，CCl3－还可与蛋白质发生共价结合，损伤线粒体，导致肝内还原性辅酶A(NADH)和三磷酸腺苷(ATP)的合成减少，进而抑制脂肪酸氧化和三羧酸循环［9］。此外，内质网受到损伤可导致脂蛋白合成发生障碍，使得三酰甘油和脂肪酸在肝细胞内大量蓄积，造成脂肪变性、甚至凋亡。因此，采用低浓度CCl4反复刺激机体，可使肝组织经“损伤—修复—损伤”的循环作用，从而造成肝脏的炎症迁延，不断形成纤维化，最终导致肝硬化的发生。通常，CCl4油溶液经皮下注射，3～5 mL·kg－1，每周 2次，12～15周即可成模。CCl4诱导肝硬化模型，机制明确、效果肯定、重现性好、剂量可控，多见于模拟突发性肝功能衰竭、肝细胞脂肪变性导致的肝硬化。然而单纯的CCl4刺激，会导致高死亡率，甚至多器官毒副反应，从而限制了其在肝纤维化及肝硬化病理发生机制研究中的应用。本研究发现造模期间大鼠死亡率与其体重有一定的关系:1周内体重下降达20 g以上的大鼠腹腔注射CCl4容易死亡且肠系膜出现黏连，因此试验期间，每周定期称量体重，若出现体重急剧下降即立即停止注射造模剂，待动物状态恢复后再继续造模。这样可以大大降低造模期间动物的死亡率，从而达到提高造模的成功率。

本实验采用苯巴比妥联合CCl4法复制肝硬化腹水模型。苯巴比妥为肝药酶诱导剂，能促进肝细胞色素P450的合成，加速CCl4的在体内代谢从而加重肝毒性，缩短了单纯使用CCl4诱导肝硬化腹水的时间。实验中CCl4油溶液浓度呈梯度递增，一方面降低了造模过程的死亡率，同时可对肝脏造成渐进性的刺激，逐步加重肝损伤，使肝脏病理逐渐进入肝硬化。

从苯巴比妥联合CCl4法复制肝硬化腹水大鼠模型的方法的相关指标来看，模型组大鼠肝脏病理检查见假小叶形成，提示肝脏病变进入肝硬化阶段;尿量明显减少，腹腔积液量显著增加，表明腹水形成，即肝硬化腹水模型形成。

［1］王金娥，姜慧杰.制备不同种类肝纤维化及肝硬化动物模型研究进展［J］.实用肝脏病杂志，2011，14(1):68 －71.

［2］郭若涵，白 彬.大型动物实验性肝纤维化及肝硬化模型的研究进展［J］.世界华人消化杂志，2014，21(5):421 －426.

［3］冯英巧，杨元生，崔淑兰.肝纤维化实验动物模型造模方法及应用研究进展［J］.广东药学院学报，2013，29(5):570 －574.

［4］马 欢，王邦茂.原发性胆汁性肝硬化动物模型研究进展［J］.国际消化病杂志，2012，32(2):93 －95.

［5］徐安书，文正荣，孙志为.肝硬化实验动物模型的研究现状［J］.医学综述，2010，16(7):1046 －1048.

［6］张云巍，胡亚卓，徐丽娟，等.四氯化碳法制备肝硬化大鼠模型中重要脏器的病理改变［J］.世界华人消化杂志，2014，22(1):74－79.

［7］宣 佶，田耀洲，曹 鹏，等.胆汁淤积性肝硬化大鼠模型的改良［J］.中国比较医学杂志，2014，24(4):57 －61.

［8］Domenicali M，Caracen P，Giannone F，et al.A novel model of CCl4induced cirrhosis with ascites in the mouse［J］.Journal of Hepatology，2009，(51):991 －999.

［9］冀润利，赵青娥.水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用［J］.中国应用生理学杂志，2012，28(3):279 －281.