吴方毅任妮丽

白介素－8与表皮生长因子对黑素瘤A375细胞增殖的影响

吴方毅1任妮丽2∗

目的: 明确IL－8与表皮生长因子(EGF)对黑素瘤细胞增殖的影响。方法: 将黑素瘤细胞A375分为9组:EGF组；EGF＋AG1478组；AG1478组；IL－8组；IL－8I组；IL－8＋IL－8I组；EGF＋IL－8组；EGF＋IL－8＋AG1478＋IL－8I组及对照组。采用MTT法检测各组细胞增殖情况；免疫印迹法检测EGFR、蛋白激酶B、丝裂原活化蛋白激酶、磷酸化蛋白激酶B、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶、磷酸化表皮生长因子受体的表达；实时荧光定量聚合酶链式反应检测EGFR与IL－8R mRNA水平的表达。结果: EGF组黑素瘤细胞增殖、上述蛋白的表达和mRNA水平显著高于对照组、EGF＋AG1478组和AG1478组。IL－8组显著高于对照组、IL－8I组和IL－8＋IL－8I组(均P＜0.05)，EGF＋AG1478组显著高于EGF组和IL－8组(P＜0.05)。结论: IL－8与EGF均能促进人黑素瘤细胞的增殖，它们之间可能具有相互协同作用，这种协同作用可能与AKT和MAPK等共同通路作用有关。

IL－8； 表皮生长因子； 黑素瘤细胞； A375

皮肤黑素瘤是增殖最快的肿瘤之一，如果出现远处转移，其中位生存期显著下降至6～9个月。1黑素瘤中IL－8水平与患者整体生存率显著相关。2－4研究表明，IL－8被证实有诱导血管生成和黑素瘤细胞运动的能力。4由于血管生成、运动和细胞增殖是肿瘤转移过程中的重要步骤，所以IL－8的表达与黑素瘤的转移潜能直接相关。5IL－8促进黑素瘤细胞增殖和进展，IL－8更具有促进黑素瘤细胞侵袭的能力。6表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor EGFR)是170 KD具有酪氨酸激酶(TK)活性的膜受体，可被表皮样生长因子(如EGF、TGF－α等)磷酸化激活，经Ras－Raf－MAPK或PI3K－PPL1－AKT等多条信号通路传递信号至核内，调节表达EGFR肿瘤的发生、发展过程，7在黑素瘤中其表达程度与病情进展、预后呈正相关。8－10IL－8与EGFR信号通路均作用于AKT及MAPK信号途径，11，12IL－8在其他肿瘤如口腔黏膜肿瘤中对于EGFR相关治疗的耐药机制扮演重要角色，13，14但是在黑素瘤中IL－8与EGFR的相互作用目

前还尚无相关研究。因此，本文主要目的即是研究IL－8与EGF在黑素瘤细胞增殖中的作用、以及是否存在相互作用及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人黑素瘤A375细胞株购于ABGENT公司(货号:CL1006)；培养于RPMI 1640培养液中以备实验。

1.1.2 试剂 IL－8购于vicmed(货号:V01340)；IL－8阻断剂(IL－8I)购于Bachem(货号:H－2268.0005)；EGF购于PIERCE(货号:RP10914)；EGFR阻断剂AG1478购于Biovision(货号:1800－25)，EGFR购于Saierbio(货号:SRP05035)、AKT购于genetex(货号: GTX10660)、MAPK购于 ProSci(货号:50－207)、PAKT购于 Bioworld(货号:AP0056)、p－MAPK购于Beyotime(货号:AM065)、p－EGFR购于Grbio(货号: Gr－617k)。

1.1.3 试剂和设备 TRizol(15596－018，Invitrogen)，cDNA第一链合成试剂盒(K1622，Fermentas)，引物合成(金斯瑞)，SYBR Green/FlouresceinqPCR Master Mix(2X)(K0242，Fermentas)，分光光度计(型号752，上海舜宇恒科学仪器有限公司)，水平电泳仪(型号JY300，北京君意东方电泳设备有限公司)，紫外分析仪(型号 JY02S，北京君意东方电泳设备有限公司)，实时荧光定量 PCR仪(illumine Eco)，DL2000 (D501A，TAKARA)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A375细胞培养于RPMI 1640培养液中(含10%胎牛血清，PBS)，0.25%胰酶加0.02% EDTA消化传代处理。

1.2.2 细胞分组刺激处理 A375细胞培养于RPMI 1640培养液中(含10%胎牛血清，PBS)，0.25%胰酶加0.02%EDTA消化传代处理，分9组处理如下:A组，A375(无处理组)；B组，EGF；C组，EGF＋AG1478；D组，AG1478；E组，IL－8；F组，IL－8I；G组，IL－8＋IL－8I；H组，EGF＋IL－8；I组，EGF＋IL－8＋AG1478＋IL－8I。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的A375细胞经0.25%胰酶消化后，用完全培养基调整细胞数为1×105个/mL，分别接种于两块96孔培养板的居中90孔，然后更换McCoy's5A无血清培养基饥饿培养24 h，设置A－I组，每组设置9个复孔(具体试剂如1.2.2所示；浓度为EGF 50 ng/mL，AG1478 20μmol/ L，IL－8 100 pg/mL，IL－8I 50μmol/L)，并设置空白对照组，培养96 h后进行检测，检测前4 h加MTT(5 mg/m L)20μL，弃上清液加DMSO 100μL，避光震荡20 min，全自动酶标仪检测570 nm处吸光度(A570)的值。细胞生长率(%)＝(实验组吸光度－空白组吸光度)/(对照组吸光度－空白组吸光度)×100%。

1.2.4 Western检测AKT、MAPK、EGFR、p－AKT、p－MAPK、p－EGFR 运用Western－blot方法检测各组EGFR信号通路关键信号分子AKT、MAPK、EGFR、p－AKT、p－MAPK、p－EGFR的表达。取适量A375细胞裂解液匀浆组织，测蛋白浓度后，各组样品取50μg总蛋白上样电泳，PAGE胶电泳(EGFR，8%；p－EGFR，10%；AKT，8%；p－AKT，10%；MAPK，12%；p－MAPK，8%)。转膜:EGFR(200 mA)，60 min；p－EGFR(200 mA)，60 min；AKT(200 mA)，40 min；p－AKT (200 mA)，90 min；MAPK(200mA)，60min；p－MAPK (300 mA)，75 min。用免疫印记法15检测。相应的一抗:EGFR，1∶1000；p－EGFR，1∶800；AKT，1∶400；p－AKT，1∶1000；MAPK，1∶200；p－MAPK，1∶800。Band-Scan扫描分析各条带灰度值，结果取被检条带与内参条带的灰度值之比。

1.2.5 实时荧光定量PCR(qT－PCR)检测EGFR和IL－8R的mRNA水平表达 在上述结果基础上，为了进一步研究IL－8与EGF在A375细胞中可能存在的相互作用，我们采用实时荧光定量PCR检测IL－8 R/ EGFRmRNA在各组细胞中的表达。RNA提取以及逆转录收集经过各组处理的细胞，加入1 mL Trizol，提取总的RNA，逆转录。16

1.2.6 统计学方法 统计学分析采用软件 SPSS 19.0。使用单因素方差分析IL－8和EGF对A375细胞增殖的影响，用卡方检验。分析AKT、MAPK、EGFR、p－AKT、p－MAPK、p－EGFR在各组细胞中表达的差异。EGFR和IL－8R之间进行表达相关性分析。如P＜0.05，则认为差异有显著性统计学意义。

2 结果

2.1 A375细胞增殖检测结果分析 48 h统计结果: E组细胞生长率显著高于 A、F、G组(115.6%，108.3%，110.7%，均P＜0.05)，A组细胞生长率显著低于F组(36.9%，P＜0.05)(图1)；B组显著高于A、C、D组(121.5%，109.7%，112.4%，P＜0.05)，A组细胞生长率显著低于D(24.3%，P＜0.05)(图2)。表明IL－8与EGF单独作用时48 h内不影响A375细胞的增殖，5 h以后IL－8与EGF均能显著促进A375细胞增殖。IL－8与EGF联合作用时48 h内即可促进A375细胞增殖，在50 h促进作用更加明显(图3，均P＜0.01)。这些结果说明IL－8与EGF均可以单独促进A375细胞增殖，并且两者对A375细胞增殖具有协同作用。

2.2 AKT、MAPK、EGFR、p－AKT、p－MAPK、p－EGFR在各组细胞中的表达 (由于IL－8R及其磷酸化抗体难以得到，所以本实验仅检测了EGFR及其磷酸化的表达)。结果发现，EGFR及其磷酸化形式在其相

应配体组显著高于配体组以及配体＋抑制剂组(p－，磷酸化)(P＜0.05，图4)，AKT、MAPK也分别显示出相类似的表达趋势。结合以上细胞增殖结果，表明IL－8与EGF可能协同促进A375细胞增殖，两者的协同作用可能与共同通路AKT以及MAPK相关。

2.3 IL－8R/EGFR mRNA在各组细胞中的表达 结果表明，IL－8R/EGFR mRNA分别在其相应配体组显著高于对照组、抑制剂组、配体＋抑制剂组(P＜0.05)，IL－8＋EGF组显著高于IL－8组、EGF组、A375＋EGF＋IL－8＋AG1478＋IL－8I组和对照组(P＜0.05)，(图5)。

图1 IL－8影响A375细胞增殖

图2 EGF影响A375细胞增殖

图3 IL－8联合EGF影响A375细胞增殖

图4 IL－8与EGF关键信号分子在A375细胞增殖过程中的表达

图5 IL－8R/EGFRmRNA在各组细胞中的表达(△t＝实验组含量－内参含量；△△t为平均值)

3 讨论

IL－8是第一个被报道的诱导黑素瘤细胞趋化和趋触性转移(haptotactic transfer)的趋化因子。17IL－8在黑素瘤中是持续表达的，是黑素瘤中的自分泌/旁分泌生长因子，同时还是侵袭和血管生成相关因子，转移性高的黑素瘤细胞表达更高水平的IL－8。18IL－8

受体抑制剂是一种潜在的治疗黑素瘤的方法。19在本项目中，IL－8能够独立促进A375细胞增殖，与之前的文献报道一致。同时，本项目中尽管因抗体因素没有研究IL－8受体及其磷酸化形式在A375细胞增殖中的表达情况，但是本实验在mRNA水平仍然发现了其表达趋势与细胞增殖情况相一致。

Bonaccorsi等20研究发现EGF通过激活EGFR和抗凋亡AKT信号通路提高对肿瘤的侵袭能力，而高浓度EGF仅能诱导一个早期的、瞬间的MAPK活性进而抑制细胞的生长。21Udart等8研究表明EGFR信号通路与黑素瘤的演变过程高度相关。人黑素瘤细胞受自分泌和旁分泌的EGF双重影响。在本实验中，EGF能独立促进A375细胞增殖，并在蛋白水平和mRNA水平显示出一致的表达趋势，也说明EGF能促进A375细胞的生长，体现出EGF可能对黑素瘤的促进作用。

众多报道发现EGFR与IL－8过度分泌有关，如HB－EGF结合EGFR后可以促使人支气管上皮细胞分泌IL－8，22MMP－12可以通过EGFR通道增加IL－8的分泌。23在肺癌中，EGF能有效结合EGFR并且激活其下游信号通路，导致IL－8的过度分泌。24

在本实验中，IL－8与EGF不仅能独立促进黑素瘤A375细胞的生长和进展，而且两者共同存在时A375细胞的生长和进展更加明显，表现出了一定程度的协同作用。这与既往其它肿瘤细胞中IL－8与EGF的相互作用基本一致，但是在A375细胞中IL－8与EGF相互作用可能与AKT、MAPK等信号通路有关，其具体详细的信号串联路径是否与其它肿瘤中的相互作用相一致还有待进一步深入的研究。

综上所述，本项目发现IL－8与EGF能分别独立促进A375细胞的增殖，且两者在促进A375增殖过程中可能具有协同作用，两者信号通路重要的信号分子及其共同通路的信号分子均有相一致的表达趋势，表明IL－8与EGF相互协同促进A375生长增殖中可能与EGFR、AKT、MAPK等重要的信号分子相关，这为人黑素瘤的双信号通路联合靶向治疗提供了可能的选择。

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(收稿:2014－11－07 修回:2014－12－29)

·临床研究·

表1 两组疗效比较

2.2 不良反应 治疗组服药后有1例出现月经错后，2例出现皮肤红斑，脱屑；对照组2例出现皮肤烧灼，刺痛感，均未作特殊处理自行消失。

3 讨论

随着人们生活水平的提高，黄褐斑已成为困扰众多女性美观的一大难题。本病病因尚未完全明了，目前认为累积的紫外线照射，雌孕激素水平，性格急躁，焦虑，紧张，失眠，化妆品使用不当都会引起。治疗尚无特别满意的方法，包括IPL，点阵激光、美白针注射，外用淡斑药物等，部分患者可取得一定的效果，但同时具有不同程度不良反应，色沉、脱屑、复发。组合外用药千白氢醌乳膏通过抑制酪氨酸转化为3，4－二苯丙氨酸(多巴)酶氧化作用和抑制其他的黑素细胞代谢过程而产生可塑性的皮肤退色。2维A酸直接影响黑素生成，降低皮肤异常色素沉着。通过表皮更新促使黑素的快速丢失，糖皮质激素有助于皮肤色素减退，抑制黑素细胞酪氨酸酶的活性，致使黑素生成障碍，单独外用时不理想，长期应用副作用较多，但当与维A酸乳膏，氢醌联合应用时，它们对皮肤色素沉着的抑制作用叠加，治疗效果明显改善，同时糖皮质激素能够对免疫有抑制作用，对上述两种药物所产生的皮肤副作用有明显的抵抗作用，减少治疗过程中的不良反应。3，4维生素C、E具有抗氧化作用。中医认为，黄褐斑由肝郁气滞，血行不畅，瘀血阻于面部浮络所致。舒肝颗粒，当归、白芍养肝血，理肝气，香附，柴胡疏肝解郁理气，丹皮，桅子，薄荷，清热凉血，散瘀除烦，白术、甘草入中焦和脾胃。诸药合用共奏，疏肝理气，散瘀消斑之功。综上所述:组合外用药联合舒肝颗粒治疗面部黄褐斑疗效确切，是治疗黄褐斑好的方法之一。

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(收稿:2014－05－06)

Effects of IL－8 and EGF on the proliferation of themelanoma A375 cells

WU Fang-yi，REN Ni-li.Department ofDermatology，Shiyan People’s Hospital Affiliated to Hubei University ofMedicine，Shiyan，442000

Objective:To determine the effects of IL－8 and epidermal growth factor(EGF)on the proliferation ofmelanoma cell.M ethods:The human melanoma cells A375 were divided into 9 groups:control group，EGF group，EGF combined AG1478 group，AG1478 group，IL－8 group，IL－8I group，IL－8 combined IL－8I group，EGF combined IL－8 group and EGF combined IL－8，AG1478 and IL－8Igroup.The proliferation ofmelanoma cellwas detected by MTT.The level of EGFR，protein kinase B(Akt)，m itogen activated protein kinase(MAPK)，phosphorylated protein kinase B(P－Akt)，phosphorylated m itogen activated protein kinase(p－MAPK)and phosphorylated epidermal growth factor receptor(p－EGFR)were detected by western blot.The expression of EGFR and IL－8RmRNA levelswere detected by qT－PCR.Results:The cell proliferation，the levels of proteins above and EGFR，and IL－8RmRNA levels in EGF groupwerehigher than that in control group，EGF combined AG1478 group and AG1478 group(P＜0.05).Those in IL－8 group were higher than that in control group，IL－8Igroup，IL－8 combined IL－8Igroup.Those in EGF combined IL－8 group was higher than that in IL－8 group and EGF group(P＜0.05).Conclusion:IL－8 and EGF can promote the proliferation ofmelanoma cells.Theremay be a synergistic effect between IL－8 and EGF，whichmay be related to the Akt and MAPK pathway.

IL－8；EGF；melanoma cell；A375

1湖北医药学院附属人民医院皮肤科，十堰，442000 2湖北医药学院附属人民医院医务科，十堰，442000∗通信作者