李　鑫，胡世弟(综述)，戴如春(审校)

(1.中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所，长沙 410011； 2.湘潭市第二人民医院内分泌科，湖南 湘潭 411100)

外周血间充质干细胞在骨代谢中的应用研究进展

李鑫1,2△，胡世弟1△(综述)，戴如春1※(审校)

(1.中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所，长沙 410011； 2.湘潭市第二人民医院内分泌科，湖南 湘潭 411100)

正常成熟骨的代谢主要以骨重建形式进行，在调节激素和局部细胞因子等的协调作用下，骨组织旧骨被吸收，新骨生成，此过程主要由破骨细胞和成骨细胞完成，两者是骨代谢过程中的重要核心细胞。成骨细胞由间充质干细胞分化产生。间充质干细胞是来源于中胚层具有多向分化潜能的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，可以在体外扩增。一定条件下，可以诱导分化为骨、软骨、韧带、肌腱、肌肉、脂肪等组织细胞[1]。间充质干细胞大部分定居于骨髓，但也可出现于外周血中[2]。外周血是一个很容易获取成体干细胞作为基础研究和临床应用的资源。抽取骨代谢疾病患者外周血标本进行实验室检查，对人体创伤小，通过检测其中间充质干细胞生物学特征，有利于疾病的早期诊断、治疗及预防。现就其在骨代谢中的应用研究进展予以综述。

1外周血间充质干细胞的存在

1.1外周血间充质干细胞存在的依据现在越来越多的证据证明，有成骨分化潜能的干细胞不仅存在于骨髓，也可出现于外周血中。Zvaifler等[2]研究发现，在人类外周血单个核细胞中，存在一部分细胞经培养后，有可塑性，附壁生长，表达间充质干细胞的特性，能分化为成纤维细胞、成骨细胞、脂肪细胞等不同组织。Kuznetsov等[3]将外周血单个核细胞扩增后移植至免疫功能不全的小鼠皮下组织中，通过特殊的探针技术，发现该部位分化出大量的骨细胞，证实哺乳动物的外周血中确实存在有成骨分化潜能的干细胞。Otsuru等[4]将绿色荧光蛋白标记的骨祖细胞植入自身骨髓系统已遭放射线破坏的大鼠体内后，在最新的骨生成部位发现有带绿色荧光蛋白标记的成骨细胞，从而证实骨祖细胞是经外周血液循环达到其他部位。近期，Zhang和Huang[5]总结提出外周血单个核细胞中包含大量能分化成不同种类的祖细胞，在合适条件下，能分化成血细胞、内皮细胞、肝细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、破骨细胞、上皮细胞等。

1.2外周血间充质干细胞的量或浓度Kuznetsov等[3]分别从小鼠、兔子、豚鼠、人类的外周血中获得有成骨分化潜能的贴壁生长细胞，这些细胞的量十分稀少，小鼠和豚鼠中包含1×10-6,兔子中为1×10-7，人类为1×10-8,甚至更少。Zvaifler 等[2]使用细胞洗涤法在人类外周血中分离出小的、圆形的单个核细胞，经体外培养后形成成纤维样细胞，该类细胞有分化为成骨细胞和脂肪细胞的潜能，在外周血单个核细胞中的浓度为0.3%～0.7%。Eghbali-Fatourechi等[6]用骨钙素抗体标记外周血单个核细胞，利用流式细胞仪检测发现其中表达骨钙素阳性细胞的比例为0.5%～0.8%，这与Zvaifler等[2]的研究数据是一致的。

1.3外周血间充质干细胞体外分离外周血间充质干细胞体外分离常见的方法有以下两种。①密度梯度离心结合贴壁生长法：根据血液中细胞成分的比重不同，采用淋巴细胞分离液将肝素化的外周血单个核细胞分离出来，再在培养瓶中培养，通过更换培养液方式除去悬浮细胞，可获得纯度达95%的间充质干细胞，此方法目前常应用于实验室研究中。②利用间充质干细胞表面标记分离细胞：主要有流式细胞仪分离法和免疫磁珠分选法。前者利用相应的荧光素标记抗体进行筛选，后者是通过间充质干细胞表面带有的抗原成分或缺失的抗原成分进行正选或负选，从而分离细胞。由于间充质干细胞特殊的生物学特性以及其含量很低，而且抗原表面不特异，当前用此方法分离纯化可行性不高[7]。

1.4外周血间充质干细胞鉴定间充质干细胞的分化可能是随机非方向性的。已经分化的间充质干细胞依旧具有转化生成其他类型间充质细胞的潜能。个体不同发育阶段的间充质干细胞的表型存在差异[8]。迄今为止对于间充质干细胞鉴定没有特异的分子标记，这方面有待进一步深入研究。目前普遍认为，间充质干细胞表达CD29、CD73、CD90、CD105、CD44和 CD166[9-11]。主要结合其形态特征、表面标记及其具有向骨、脂肪、软骨等多种方向的分化潜能而进行鉴定[12]。

2外周血间充质干细胞的性质及功能

人类外周血间充质干细胞的浓度在一定年龄段内，随着年龄增加而增长。Eghbali-Fatourechi等[6,13]通过流式细胞学检查、反转录聚合酶链反应等技术手段检测证实了该观点，其在2005年通过对比青春发育期男性及正常成年男性两组人群，就已提到青春发育期男性在生长高峰期，外周血中表达骨钙素阳性细胞的浓度是持续增加的。Dalle等[14]发现，骨质疏松患者外周血间充质干细胞数量也是增加的，只是它们经历了异常的骨分化。最近，Fu等[15]通过染色体组型分析、抵抗H2O2诱导的细胞凋亡等实验比较外周血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞，发现它们的生物学特征是一致的。Undale 等[16]通过比较绝经后女性外周血中和骨髓中的间充质干细胞也得出了该结论。然而，间充质干细胞是怎样到达外周血液参与骨重建的？早在2001年Hauge等[17]建立的血管骨重建单元学说有助于解释此疑问。该学说提到，骨重建单元中含有毛细血管，有分化为成骨潜能的细胞(包括骨髓间充质干细胞、骨髓非附壁成骨前体细胞、血管壁中表达CD34阳性的祖细胞分化成的外膜细胞、普通的内皮祖细胞)不是直接在骨髓腔中分化成形到达皮质骨，而是进入毛细血管输入端，部分在血管中分化形成成骨细胞黏附于皮质骨参入骨重建，部分从毛细血管输出端离开。在骨质疏松患者中[14]，由于骨转换增加，动员至外周血的成骨祖细胞也是增加的，但是这些细胞由于基因表达异常，不能分化为正常有功能的成熟骨细胞。间充质干细胞分化为成骨细胞的数量减少，但分化为脂肪细胞的数量增加，提示脂肪细胞分化增加可能是以减少成骨分化为代价的。所以，外周血间充质干细胞异常分化导致骨重建异常是引起骨量丢失的一个重要发病机制。

3外周血间充质干细胞可能存在的临床应用

3.1辅助早期诊断骨代谢疾病Dalle等[14]选取正常和骨质疏松两类人群作为研究对象，从外周血中分离培养间充质干细胞，将形成的成纤维细胞集落形成单位作为评价指标，同时分别完善两组人群的腰椎骨密度，发现骨质疏松患者成纤维细胞集落形成单位较正常人多，提示骨质疏松患者外周血间充质干细胞的量与骨密度呈反比。因此，检测外周血间充质干细胞量可能作为一种非侵袭性方法辅助早期诊断骨代谢病。

3.2治疗骨代谢疾病从外周血中获取间充质干细胞简便易行、创伤小、易于分离培养，增殖能力强，可体外克隆扩增，回输入体内治疗骨代谢疾病。Tadokoro等[18]采用同种异体间充质干细胞静脉输注治疗低磷酸酶症患者取得了成功。骨髓来源于患儿的父亲，取出新鲜骨髓体外培养，并用不同的培养方法促进间充质干细胞增殖，再将其静脉输注入患儿体内，获得了较好的疗效。Toupadakis等[19]在两组小鼠股骨骨折模型中，一组经皮下注射一种趋化因子4受体抗体——AMD3100，动员骨髓干细胞移至外周血液，另一组注射生理盐水作为对照。3个月后，分别检测两组小鼠中外周血间充质干细胞的含量，同时使用计算机断层扫描骨折部位，结果发现注射AMD3100的小鼠外周血液中间充质干细胞含量较多，且骨折部位骨密度明显增加。最近一项5年的随访研究发现，在股骨头坏死患者的早期阶段，经股动脉注入自体间充质干细胞，有助于缓解疼痛，提高髋关节功能，延迟股骨头坏死的进展[20]。

3.3结合传统骨代谢指标监测药物疗效Suriyachand等[21]选取43例年龄为25～90岁的人群，分为<60岁、60～79岁、≥80岁三个不同年龄组，分别用骨钙素抗体标记外周血单个核细胞，利用流式细胞仪分析，同时选取Ⅰ型胶原交联C端肽、Ⅰ型前胶原N端肽及骨钙素三个骨代谢评价指标，结果发现年龄≥80岁组外周血成骨祖细胞百分比与成骨代谢指标呈正比。Rubin等[22]在甲状旁腺功能减退的患者中，通过调节甲状旁腺激素的剂量，促进外周血成骨祖细胞增加，发现成骨祖细胞数量增加与髋骨中成骨功能指标变化一致。基于此相关性，可利用外周血间充质干细胞来预测成骨细胞的活性，用于临床骨代谢疾病药物跟踪治疗的疗效评价。

3.4通过判断成骨分化潜能预防骨代谢疾病Valenti等[23]通过分析外周血间充质干细胞分化过程中的基因表达，证实该类细胞能分化为成骨细胞。鉴于此特点，未来可以检测间充质干细胞向成骨细胞分化过程中某特征基因的表达而了解成骨分化潜能。根据Smiler等[24]研究，可通过流式细胞仪检测干细胞表面分别代表破骨和成骨分化的分子标记，比骨代谢生化指标更早地了解骨转换倾向，早期判断骨质量改变程度，尽早选择药物干预，预防骨质疏松等骨代谢疾病。

4小结

应用外周血间充质干细胞，不仅可能建立临床可用的骨代谢疾病的最新检测手段和方法，而且能早期诊断、治疗、预防代谢性骨病。但在判断骨分化过程中，由于代表破骨和成骨分化潜能的分子标志物特异性不高，可能需要多分子标志联合检测，提高其精确性，有待进一步深入研究。此外，外周血间充质干细胞在正常的骨重建、骨折愈合等过程中所扮演的精确角色仍不能完全肯定，需要进一步探索。同时，间充质干细胞的许多生物学特征和多分化潜能的分子机制尚不完全明确，还需不断探究，进一步掌握它们的分化能力、可移植性和生物安全性。

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摘要：外周血间充质干细胞是从外周血液中分离得到的一种成体干细胞，性质与骨髓间充质干细胞性质一致，异常分化引起骨代谢平衡改变导致骨量丢失。外周血间充质干细胞能即时动态地反映正在进行的骨重建状况，对代谢性骨病的早期诊断、预测骨丢失和监测药物疗效等均具有重要的临床意义，在骨代谢疾病的应用中前景广泛。但是，目前仍有许多关于间充质干细胞的疑问，包括其在骨重建、骨折愈合中的具体作用机制等还需进一步探究。

关键词：间充质干细胞；外周血；骨代谢；临床应用

Research Progress of Application of Peripheral Blood Derived Mesenchymal Stem Cells in Bone MetabolismLIXin1,2,HUShi-di1,DAIRu-chun1.(1.DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,theSecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410011,China; 2.DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,XiangtanCitySecondPeople′sHospital,Xiangtan411100,China)

Abstract：Peripheral blood mesenchymal stem cells(PBMSCs) is a kind of adult stem cells.Its character is similar to bone marrow mesenchymal stem cells,and the change of bone metabolism caused by PBMSCs abnormal differentiation leads to bone loss.PBMSCs can reflect the status of bone remodeling timely,dynamically,which has important clinical significance for early diagnosis of metabolic bone diseases,prediction of bone loss,monitoring drug efficacy,and has a wide prospect in the clinical application of bone metabolism diseases.But there are still many questions about mesenchymal stem cells,which include the mechanisms in bone remodeling and fracture healing,therefore further research is still needed.

Key words：Mesenchymal stem cells; Peripheral blood; Bone metabolism; Clinical application

收稿日期：2014-09-22修回日期：2014-12-01编辑：伊姗

基金项目：国家自然科学基金(81270960，81070695)；教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-11-0507)；中南大学中央高校基本科研业务费专项资金(2014zzts359)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.15.003

中图分类号：R318；R589.5

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)15-2694-03