周 红(综述)，张 波(审校)

(广西壮族自治区妇幼保健院广西妇产医院广西儿童医院生殖中心，南宁530003)

人类辅助生殖技术的理想结局是生育一个健康胎儿，关注点不仅是临床妊娠率，更在于单胎活产率。体外受精(in vitro fertilization，IVF)及其衍生技术发展已三十余年，胚胎成功植入与功能正常的囊胚、良好子宫容受性及其相互作用有关，因此对胚胎体外培养的研究逐渐细化而深入。研究显示，与卵裂期胚胎移植相比，移植囊胚期胚胎临床种植率较高，囊胚培养技术日益成熟，使移植胚胎策略逐渐向单囊胚移植倾斜，从而提高活产率、降低多胎率［1-2］。但受体外培养环境所限，并非所有高评分的卵裂期胚胎都能体外发育至囊胚期。在现阶段，充分认识囊胚培养的利与弊，有利于获得更好的助孕结局。现就囊胚培养的利与弊予以综述。

1 囊胚培养的益处

1.1 胚胎的进一步筛选和修复人类胚胎培养发育首先是卵裂期胚胎，再到种植前囊胚期胚胎。其代谢有两个不同阶段，一是从受精到胚胎基因组的激活，二是从基因组激活到种植。通过动物及人胚胎的体外培养发现，早卵裂期胚胎形态学上的特点不能真正揭示胚胎本身的发育潜能和信息，体外继续培养的过程中，没有发育潜能的胚胎或携带有异常染色体和基因的胚胎常被自然筛选掉，只有质量好的胚胎才能发育至囊胚期［3-4］。Staessen等［5］研究提示，经过荧光原位杂交技术对不同阶段胚胎非整倍体筛查的结果显示，8细胞卵裂期胚胎染色体正常率为41.3%，而继续培养至第5日囊胚期染色体正常率为65%，其种植机会增加，妊娠率高于卵裂期胚胎;部分染色体异常且质量差的胚胎在体外继续培养，无法进一步发育。人类胚胎自然流产的首要原因与胚胎染色体的数目发生异常即非整倍体的产生有关。一项前瞻性研究对第3日诊断为非整倍体状态的83个卵裂期胚胎继续培养至第5日再做活检，发现能发育至囊胚期的胚胎与发育至致密桑葚胚阶段的胚胎相比有较高的自我纠正率(38.1%比24.2%)，说明随着胚胎体外培养至囊胚期，其染色体异常(非整倍体和嵌合型胚胎)有可能获得改善及修复，更佳地评估胚胎后基因组激活［6］。一项回顾性荟萃分析结果显示，在IVF/卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术中，与卵裂期胚胎移植相比，囊胚移植明显增加活产率［7］。

1.2 子宫环境更适于胚胎种植 胚胎的成功植入需要功能正常的囊胚和良好的子宫内膜容受性，并且需两者相互作用及多系统旁分泌的调控。人类子宫与输卵管的环境分别适合不同类型胚胎发育，在自然妊娠中卵裂期胚胎在输卵管发育，子宫种植最佳时期是囊胚期。在对胚胎干细胞的相关研究中提示，囊胚的形成从细胞融合到囊胚腔出现、扩张，经历了从母体调节向胚胎调节的基因调控转换［8］。自然妊娠中，胚胎种植于子宫的阶段就是囊胚期，因此，囊胚期移植胚胎与子宫内膜的同步性更佳。Fanchin等［9］的研究表明，囊胚移植阶段子宫收缩频率明显低于卵裂期胚胎移植阶段［(1.5±0.2)次/min比(4.4±0.2)次/min］，该阶段子宫收缩明显减少，有利于避免胚胎被宫缩排出，更有利于胚胎种植。同时，囊胚期胚胎体积较大，子宫收缩较小，相关研究提示囊胚移植患者异位妊娠的发生率较低［10］。

1.3 单囊胚移植是可接受的移植策略 在IVF-胚胎移植中，由于无法真正预测胚胎的发育潜能，为了保证一定的临床妊娠率，往往移植2～3枚卵裂期胚胎，通过增加移植胚胎数期望能增加妊娠率，因此，多胎妊娠风险明显增加，多胎妊娠率可高达25%～50%，甚至出现较多的高序多胎妊娠［11］。一些随访资料提示，由于移植胚胎数目2～3个，致双胎妊娠发生率增加了70%，三胎妊娠发生率增加了400%［12］。当胚胎培养到囊胚期，通过评估已分化的内细胞团及滋养外胚层，使选择单个发育潜能高、较高种植率的囊胚进行移植成为可能，既可以得到较高的妊娠率，又能有效降低多胎妊娠率［13］。研究显示，采取选择性单囊胚移植策略干预后，移植胚胎数目明显降低(由2.12枚减为1.60枚)，胚胎种植率及临床妊娠率明显提高，多胎妊娠率明显降低(由29.37%降为15.38%)［14］。

1.4 体外延长培养提高胚胎利用率 按照现有的卵裂期胚胎形态学评分体系，取卵后第3日，对低评分的胚胎冷冻保存的意义不大，但对307枚低评分胚胎体外延长培养的研究提示，低评分胚胎体外延长培养后囊胚形成率为17.26%［15］。甄璟然等［16］的研究也认为，取卵后体外培养第3日形态学较低质量的胚胎仍有部分具有发育至囊胚的潜能(低质量胚胎总的囊胚形成率27.56%)，在第3日时对这些胚胎继续进行培养至第6日，可能减少胚胎的浪费并得到更好临床结局。另有学者研究提出，现有的胚胎评分方法在第3日认为无冷冻价值的非优质胚胎，仍具有不同程度的发育潜能，通过继续体外培养，进一步筛选出具有发育潜能的胚胎，继而冷冻保存囊胚，可提高患者的累积妊娠率，从而可以最大限度地利用胚胎，减少患者的损失［10，17］。

1.5 有利于胚胎植入前遗传学诊断技术的开展 胚胎植入前遗传学诊断是辅助生殖技术与遗传学诊断技术相结合的技术，该技术的重要环节之一在于囊胚培养技术。胚胎活检一般在胚胎发育的两个时间段进行，一是在受精后第3日发育至6～8个细胞阶段的卵裂期胚胎，取全能性的卵裂球1～2个细胞活检，胚胎继续培养发育形成囊胚，再根据活检结果，选择囊胚期胚胎进行移植;另一方面是胚胎培养至囊胚期，取胚胎滋养层细胞10个以上细胞进行活检，不仅可增加可供诊断的细胞数，提高准确率，同时，取滋养层细胞活检对胎儿发育的影响较小;但由于囊胚期活检检测结果后至，需要期待冻融周期移植［18］。

1.6 冻融囊胚复苏率及着床率较高 胚胎冷冻保存是人类辅助生殖技术中不可缺少的一部分，在提高累积妊娠率、增加移植机会等方面起重要作用。在玻璃化冷冻保存胚胎体系不断完善后，冻融囊胚的优势体现在:①囊胚细胞数目多;②滋养层细胞损伤后修复能力强;③囊胚细胞小且表面积/体积比大，对脱水、复水造成的体积变化耐受性更佳;④囊胚复苏后很快能判断是否存活等［19］。研究表明，囊胚冷冻保存较卵裂期胚胎的复苏率高、临床种植率高［20］。因此，在囊胚移植数目减少的情况下，冻融囊胚复苏可有效提高IVF技术的累积妊娠率及活产率。

2 囊胚培养面临的问题

2.1 继续培养需要更高标准的胚胎实验室培养环境 胚胎体外培养，在不同时期对胚胎培养液成分的要求是不同的。卵裂期胚胎继续培养，形成囊胚的影响因素很多，尤其对实验室的体外培养体系有更高要求。胚胎在发育至8细胞水平晚期将发生致密化，为胚胎进一步细胞分化成滋养细胞和内细胞团奠定结构基础。胚胎致密化后糖酵解成为重要的能量产生通路，胚胎此时对葡萄糖的利用度增加，有高度依赖性。从卵裂期胚胎到囊胚期胚胎还需要(如蛋白、氨基酸等)各种营养物质的均衡，培养液的渗透压、温度、酸碱度等的调节及胚胎实验室优良的培养环境、无菌条件、人员操作、质控等，使实验室工作量也因此增加［19，21］，同时继续培养还应该尽量缩短胚胎在培养箱外暴露的时间，才能降低外界环境对胚胎的损伤。体外培养条件不良最终影响囊胚形成率及种植率、活产率。

2.2 体外延长培养有无囊胚形成而取消周期的风险 对高龄不孕妇女而言，获卵数较少、形成胚胎较少，继续培养最终无胚胎移植的周期取消率会明显增高。Glujovsky等［22］分析显示，囊胚移植在活产率方面优于卵裂期胚胎移植(32%比42%)，但囊胚移植组延长的培养可能无囊胚形成，移植取消的概率高，使卵裂期胚胎的累计妊娠率优于囊胚移植(56.8%比46.3%)，囊胚移植未显现出明显优势。顾亦凡等［23］的研究显示，人类发育欠佳胚胎仅有20.9%能培养到囊胚阶段，有53.8%的患者由于继续培养无囊胚形成而取消周期，因此，对于人类发育迟缓或形态不佳的胚胎，不建议继续进行囊胚培养，尽量在第3日进行胚胎移植。

2.3 双囊胚移植将产生更高的多胎妊娠率 囊胚的临床种植率在40%～50%［18，24］，在我国，目前移植胚胎策略未针对移植囊胚的数目作出界定，双囊胚移植在获得可能高的临床妊娠率的同时，必然导致医源性的多胎妊娠率进一步增加，相应的临床助孕的并发症及产科风险增加。不孕夫妇受国家计划生育相关政策限制只生一胎，患者不仅希望妊娠，也追求双胎妊娠，往往难以接受单囊胚移植;当然，随着单独二胎政策的实施，这类情况可能会有所改善。Nyboe Andersen等［25］的研究指出，选择性单胚胎移植与双胚胎移植的累积活产率差异无统计学意义，但关键在于累积治疗的周期数。

2.4 可能增加出生婴儿性别偏倚及单卵双胎的风险 囊胚培养、移植在很大程度上均是采用最优质胚胎进行移植，相对男性胚胎的发育速度显著快于女性胎儿，是否因此导致男胎出生比率高，尚有争议。Chang等［26］报道，囊胚移植导致男性婴儿出生比例升高，且单卵双胎发生率增加。但一些研究显示，胚胎性别与胚胎形态学评级有关，与是否采取囊胚移植无关;延长胚胎体外培养发现，男性胚胎发育速度显著快于女性胚胎，在5AA/6AA的囊胚中有72%为男性胚胎，三级胚胎中仅有40%为男性胚胎［27］。另外，造成单卵双胎的具体原因仍不清楚，可能与妇女的年龄、卵巢刺激、体外延长培养、体外培养条件的改变以及透明带的损伤等有关。一项对9篇文献超过40 000个周期的荟萃分析表明，囊胚培养似乎是导致单卵双胎的一个重要因素［24］。对ICSI的研究提示，囊胚期胚胎移植单卵双胎发生率明显高于卵裂期胚胎(3.9%比0.7%)［28］，推测对透明带的操作及辅助孵化处理可能是囊胚移植单卵双胎发生率增加的原因。而Papanikolaou等［29］对1951例新鲜IVF/ICSI周期的回顾性研究表明，与卵裂期单胚胎移植相比，单囊胚移植并不增加单卵双胎的风险(2.6%比1.8%)。另有研究显示，移植囊胚与卵裂期胚胎单卵双胎率无差异，囊胚培养并未增加单卵双胎的发生率［14］。单卵双胎的发生可能与辅助生殖技术中的一些操作(如辅助孵化、ICSI、胚胎活检等)相关，但与囊胚培养的相关性尚需进一步研究。

2.5 基因印记异常风险可能随体外培养时间延长而增加在辅助生殖技术中，IVF、胚胎体外培养的过程是基因印迹擦除、建立和维持的关键窗口期，体外环境可能干扰胚胎基因印记，导致相关遗传性疾病的发生率上升。一些研究发现，基因印记缺陷可能与母系位点低甲基化、超排卵和胚胎体外培养有关［30］。在许多动物研究发现，对胚胎的延长培养、培养环境及培养液成分等的变化，可能导致印迹基因的改变［31］。一项对小鼠单个囊胚DNA甲基化的微阵列分析结果表明，体外培养过程、囊胚冷冻的人工皱缩技术、冷冻保存等可能产生广泛的基因效应［32］。囊胚培养增加了胚胎体外操作及培养的时间，囊胚内细胞团对培养液中的成分变化更敏感，对培养基耐受性较差，可能潜在损伤更多。

3 选择性囊胚培养与单囊胚移植使其优势最大化

人类辅助生殖技术的应用，终极目标是辅助生殖回归自然。囊胚培养、移植的主要优势在于其是有效、易行的胚胎选择方法，并有较高的种植率，使单胚胎移植效率提高，并提高累积妊娠率及活产率。因此，胚胎实验室培养环境在满足囊胚培养的更高要求后，对于年轻、卵巢反应好的患者，选择性单囊胚移植应该是较有效率的助孕策略。另一方面，对于卵巢反应差、胚胎数量少的患者，考虑到继续培养的风险，可能依然是采用卵裂期胚胎移植更为合适。

4 小结

正确看待囊胚培养的利弊，利用有效胚胎体外培养体系进一步筛选胚胎，充分发挥IVF技术优势，结合临床促排卵与子宫内膜等方案选择的探索，选择性地将具有高发育潜能的单个囊胚移植到适宜种植的子宫内，既维持可接受的临床妊娠率，又有效控制了多胎妊娠率，最终实现单胎活产，达到辅助生殖技术的理想目标。

［1］JOINT SOGC-CFAS.Guidelines for the number of embryos to transfer following in vitro fertilization No.182，September 2006［J］.Int J Gynaecol Obstet，2008，102(2):203-216.

［2］Blake DA，Farquhar CM，Johnson N，et al.Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted conception［J/CD］.Cochrane Database Syst Rev，2007(4):CD002118.

［3］胡煜，刘吉，李宝山，等.人类辅助生殖技术中DAY3胚胎质量与囊胚形成相关性分析［J］.中国优生与遗传杂志，2012，20(7):114-116.

［4］赵雅云，周黎明，王华，等.囊胚培养的相关因素分析［J］.现代实用医学，2011，23(5):569-571.

［5］Staessen C，Platteau P，Van Assche E，et al.Comparison of blastocyst transfer with or without preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in couples with advanced maternal age:a prospective randomized controlled trial［J］.Hum Reprod，2004，19(12):2849-2859.

［6］Barbash-Hazan S，Frumkin T，Malcov M，et al.Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential［J］.Fertil Steril，2009，92(3):890-896.

［7］Wang SS，Sun HX.Blastocyst transfer ameliorates live birth rate compared with cleavage-stage embryos transfer in fresh in vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection cycles:reviews and meta-analysis［J］.Yonsei Med J，2014，55(3):815-825.

［8］Kim S，Kim JH，Lee E，et al.Establishment and characterization of embryonic stem-like cell from porcine somatic cell nuclear transfer blastocysts［J］.Zygote，2010，18(2):93-101.

［9］Fanchin R，Ayoubi JM，Righini C，et al.Uterine contractility decreases at the time of blastocyst trasfers［J］.Hum Reprod，2001，16(6):1115-1119.

［10］高梦莹，李永刚，马艳萍，等.囊胚培养与囊胚移植的临床应用［J］.生殖与避孕，2011，31(11):765-768.

［11］丰有吉，沈铿.妇产科学［M］.2版.北京:人民卫生出版社，2010:412-414.

［12］Black M，Bhattacharya S.Epidemiology of multiple pregnancy and the effect of assisted conception［J］.Semin Fetal Neonatal Med，2010，15(6):306-312.

［13］Min JK，Hughes E，Young D，et al.Elective single embryo transfer following in vitro fertilization［J］.J Obstet Gynaecol Can，2010，32(4):363-377.

［14］张波，冯贵雪，周红，等.选择性单囊胚移植在降低多胎率中的应用［J］.国际生殖健康/计划生育杂志，2012，31(1):38-41.

［15］冯贵雪，张波，方伟芬，等.体外延长培养筛选低评分胚胎中具有发育潜能胚胎的可行性探讨［J］.中国优生与遗传杂志，2007，15(11):99-100.

［16］甄璟然，王雪，孙正怡，等.人类低质量卵裂期胚胎体外发育至囊胚能力的研究［J］.生殖医学杂志，2011，20(4):253-256.

［17］莫美兰，宋成，张宏展，等.低等级胚胎继续培养的价值与其临床结局［J］.生殖医学杂志，2012，21(3):205-208.

［18］庄广伦.现代辅助生殖技术［M］.北京:人民卫生出版社，2005:308-404.

［19］黄国宁，孙海翔.体外受精-胚胎移植实验室技术［M］.北京:人民卫生出版社，2012:259-299.

［20］Kosasa TS，McNamee PI，Morton C，et al.Pregnancy rates after transfer of cryopreserved blastocysts cultured in a sequential media［J］.Am J Obstet Gynecol，2005，192(6):2035-2039.

［21］黄国宁，刘东云，韩伟.辅助生殖技术实验室的建设及其质量控制［J］.中国实用妇科与产科杂志，2010，26(10):755-758.

［22］Glujovsky D，Blake D，Farquhar C，et al.Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology［J/CD］.Cochrane Database Syst Rev，2012，7:CD002118.

［23］顾亦凡，陆长富，龚斐，等.人类发育欠佳胚胎在卵裂期及囊胚期移植后的临床结局比较［J］.中国现代医学杂志，2013，23(17):67-71.

［24］金海霞，孙莹璞.囊胚移植从双胚胎移植到单胚胎移植的经验体会［J］.生殖医学杂志，2012，21(2):125-128.

［25］Nyboe Andersen A，Goossens V，Bhattacharya S，et al.Assisted reproductive technology and intrauterine inseminations in Europe，2005:results generated from European registers by ESHRE.The European IVF Monitoring Programme(EIM)，for the European Society of Human Reproduction znd Embryology(ESHRE)［J］.Hum Reprod，2009，24(6):1267-1287.

［26］Chang HJ，Lee JR，Jee BC，et al.Impact of blastocyst transfer on offspring sex ratio and the monozygotic twinning rate:a systematic review and meta-analysis［J］.Fertil Steril，2009，91(6):2381-2390.

［27］Alfarawati S，Fragouli E，Colls P，et al.The relationship between blastocyst morphology，chromosomal abnormality，and embryo gender［J］.Fertil Steril，2011，95(2):520-524.

［28］da Costa AL，Abdelmassih S，de Oliveira FG，et al.Monozygotic twins and transfer at the blastocyst stage after ICSI［J］.Hum Reprod，2001，16(2):333-336.

［29］Papanikolaou EG，Fatemi H，Venetis C，et al.Monozygotic twinning is not increased after single blastocyst transfer compared with single cleavage-stage embryo transfer［J］.Fertil Steril，2010，93(2):592-597.

［30］Li T，Vu TH，Ulaner GA，et al.IVF results in de novo DNA methylation and histone methylation at an Igf2-H19 imprinting epigenetic switch［J］.Mol Hum Reprod，2005，11(9):631-640.

［31］Arnaud P，Feil R.Epigenetic deregulation of genomic imprinting in human disorders and following assisted reproduction［J］.Birth Defects Res C Embryo Today，2005，75(2):81-97.

［32］Wright K，Brown L，Brown G，et al.Microarray assessment of methylation in individual mouse blastocyst stage embryos shows that in vitro culture may have widespread genomic effects［J］.Human Reprod，2011，26(9):2576-2585.