钟阿红，张振宇(综述)，余进进，吴亦波(审校)

(1.苏州大学附属第四医院妇产科，江苏无锡214062;2.江南大学附属医院无锡市第四人民医院a.妇产科，b.生殖中心，江苏 无锡214062)

微RNA(microRNA，miRNA)是一类由21～23个核苷酸组成的内源性、非编码、单链小分子RNA，通过完全或不完全碱基互补配对原则与特定基因的信使RNA的3'-非翻译区或5'-非翻译区结合，在转录后水平通过对靶信使RNA降解或抑制翻译过程而发挥负性调控作用。1993年，Lee等［1］通过对秀丽新小杆线虫的研究首先报道了miRNA的存在。2000年，Reinhart等［2］在线虫发育调控的研究中发现了第2个miRNA——let-7，从而拉开了对miRNA研究的序幕。自miRNA被发现以来，人们已经发现了数万种miRNA，这一数字仍在不断增加。相信随着科学的进步，技术的发展，越来越多的未知miRNA将会被发现，同时也将会面临新的挑战。现就miRNA的特征及研究进展进行概述。

1 miRNA简介

1.1 miRNA的命名 Sanger microRNA序列数据库(miRBase)是一个提供包含miRNA的序列数据、miRNA的命名以及对miRNA靶基因预测的全方位数据库。作为存储miRNA信息的权威数据库，miRBase具有对miRNA基因名称独立注册的权利。早在miRNA被大规模发现的时候，其命名机制就被确定下来，当前已发展了一套成熟的miRNA命名系统［3］。目前，miRBase已于2014年6月升级至miRBase 21.0版。在该版本中，共收录28 645个miRNA前体和35 828个成熟体miRNAs，涵盖了223个物种。相比上一版本(miRBase 20.0版)，新版数据库的可靠性进一步提升，清除了一些不明确的和错误注释的序列，又有72个条目被清理出数据库。miRNA的命名一般遵循以下基本规则:(1)miRNA的成熟体通常用miR表示，而miRNA的前体则用mir表示，然后是其物种名称(采用3～4个字母的缩写来表示)以及被发现的时间次序(一般使用阿拉伯数字表示，如hsa-miR-200，mmu-miR-200);(2)同源性较高的miRNA在数字后面加上英文小写字母(a，b，c，…)，如 hsa-miR-200a、hsa-miR-200b 和has-miR-200c;(3)如果一个成熟的miRNA不是由同一条染色体上的DNA序列转录加工产生，则在后面加上阿拉伯数字以区别(如hsa-miR-16-1和hsa-miR-16-2);(4)若一个miRNA前体的两个臂可以分别转录加工成 miRNA，则用“-5p”和“-3p”以区分，分别表示从该前体的5'端臂和3'端臂加工而来(如 hsa-miR-125a-5p和 has-miR-125a-3p)［3］。以前认为，这两个miRNA表达水平有差异，将表达水平较低的miRNA在后面加上*号表示，而表达水平较高的miRNA后面则不加任何符号。并且一般认为miRNA*是没有功能的，但是有研究报道miRNA*其实也是有功能的［4］，在某些组织里表达水平甚至高于miRNA［5］。自miRBase19.0版起，这种 miRNA*命名方式已经终止使用。另外，命名规则确定之前已经被发现的miRNA，如lin-4和let-7，则仍使用原来的名字。

1.2 miRNA的生物合成 miRNA的生物合成是一个相当复杂的生物学过程，它具有多个步骤。首先，在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，核内编码miRNA的基因转录为初级miRNA;随后，经Drosha-DGCR(Drosha-DiGeorge syndrome critical region gene)8复合物的帮助，初级miRNA被剪接成长为70～80 nt的具有类似发夹样结构的miRNA前体;接着，在核质(细胞质)转运输出蛋白5的参与作用下，miRNA前体被自细胞核转运至细胞质中;然后，经核酸酶Dicer作用，miRNA前体被进一步剪切成长度约为22 nt的双链RNA分子;最后，双链RNA分子在解旋酶的酶解作用下，一条链被降解，另一条链则成为成熟的miRNA，并与Argonaute蛋白一起，与特异的RNA沉默复合物结合后形成特异的RNA沉默复合物-信使RNA复合物，再按照碱基互补原则与靶信使RNA结合，从而在转录后水平发挥相关负性调控作用。

1.3 miRNA的生物特性

1.3.1 高度的进化保守性 目前研究认为，成熟的miRNA在物种进化过程中具有一定的保守性，人们在低等生物和高等生物基因组中均可以找到同源miRNA，如人和灵长类动物的miRNA之间就有40%的同源基因［6］。miRNA序列结构上的这种高度保守性具有重要的生物学意义，提示可能在不同生物体的生长发育过程中，miRNA具有比较一致的表达调控机制，同时这也为生物进化的同源性提供了某种依据，对人们了解物种演变的过程具有非常重要的意义。

1.3.2 表达的空间特异性 miRNA只在特定的细胞或组织表达，如miR-124和miR-9在神经系统内高表达，但是两者仍有区别，miR-124主要表达于神经前体细胞中，而miR-9则主要表达于神经元和胶质细胞中［7-10］。miRNA在不同组织间、细胞间的差异表达，向人们提示miRNA可能在生物体的组织或细胞分化过程中发挥了作用，也对人们理解生物体在正常和疾病状态下miRNA表达的形式和水平的不同有一定的帮助。

1.3.3 表达的时间特异性 miRNA只在特定的时间或发育阶段表达。如miR-1和let-7能在成年果蝇中表达，而未能在培养20～24 h的果蝇胚胎细胞中检测到［3］。miRNA的表达呈现出时间发育特异性，提示miRNA可能参与了生物体个体的发育过程，并且极有可能在其中发挥了调控作用。

1.4 miRNA的功能 miRNA通常位于基因间隔区，但也有部分存在于遗传编码基因的内含子中［11］。它虽仅占人类基因总数的2%，却调控着人类基因组中30%以上的基因，是基因调控网络中的核心成分［12］。miRNA在生物体内广泛存在，对包括生物体的细胞增殖、分化、凋亡和生物体个体的发育以及疾病的产生、进展及预后等生命活动均发挥着广泛的生物学调控作用，故而对其进行深入研究具有非常重要的意义［13-14］。当今，miRNA已成为肿瘤研究领域中的热点。Calin等［15］于2002年最先报道了miRNA在肿瘤发生中的作用。随着研究的不断深入，人们发现基因组的不稳定性是肿瘤的常见特征之一，约50%的miRNA基因位于与肿瘤相关的染色体的脆性位点上，而且不同类型的肿瘤具有明显不同的miRNA表达谱［16］。miRNA具有类似癌基因或抑癌基因的功能，表现为癌基因的活化或抑癌基因的失活，如 Let-7、miR-15、miR-16、miR-34a/b/c、miR-124、miR-143、miR-145、miR-122a等在多种肿瘤中相继被证实发挥类似抑癌基因的作用［17-22］，而 miR-21、miR-10b、miR-221 和 miR-222 等在多种肿瘤中扮演着类似癌基因的角色［23-26］。

1.5 miRNA的靶基因预测 由于miRNA的功能与其所调控的靶基因密切相关，所以研究miRNA的功能必将涉及对miRNA靶基因的鉴定。但是，miRNA对靶基因的调节通常并不是一一对应的，大多数情况下，一个miRNA同时对多个靶基因发挥调控作用，而一个基因也同时被多个miRNA所调控;况且生物体具有非常复杂的内在机制，miRNA的表达调控并不是孤立存在的，miRNA对基因的调节存在着多种调控机制和作用模式，所以，鉴定miRNA靶基因既是这一研究领域的重点，也是该研究领域的难点。生物信息学的飞速发展使科学家们能够使用特殊的软件和数据库来预测miRNA的靶基因［27］。生物信息学方法主要是基于miRNA和靶基因间的相互作用具有一定的规律性，通过建立计算模型，整合已有的生物学数据，应用某种算法或程序来预测miRNA的靶基因。目前常规的算法和程序一般遵循以下几条规律:①miRNA靶位点在不同物种之间具有保守性;②miRNA与靶基因之间具有互补性;③miRNA与信使RNA相互之间具有热稳定性;④miRNA5'端的结合能力比3'端的结合能力强［28］。除了以上这些基本规则外，不同的算法和程序还会根据各自总结的规律进行改进和优化。生物信息学预测方法的应用前景广阔，使寻找miRNA靶基因有律可循，但是这种方法得出的结果假阳性率很高;并且运用生物信息学预测的miRNA与信使RNA相互作用只是一种理论上的结合，在不同条件下，miRNA究竟以何种作用形式以及水平存在并不能通过生物信息学预测。常用的miRNA靶基因预测网站主要包括，①TargetScan:科学家在2003年开发的一款用于预测哺乳动物miRNA靶基因的软件，它主要是基于miRNA与信使RNA的碱基互补配对原则，利用miRNA结构序列上的保守性和信使RNA与miRNA相互之间的热力学稳定性，来预测miRNA靶目标，它为人们提供网络实时服务，是目前使用频率最高的miRNA靶基因预测软件;②miRbase:该软件可以通过名称、关键词或序列等方式进行检索，并可通过链接查询有关该miRNA的主要文献，对miRNA进行基因组背景分析及靶标预测等;③miRanda:是第一个利用生物信息学对miRNA靶基因进行预测的软件，于2003年开发设计，应用范围广，但假阳性率较高;④PicTar:是研究人员通过特定的计算法则来预测脊椎动物、线虫、果蝇和人类的非保守但共表达的miRNA的靶基因，并通过实验方法进行验证。

1.6 miRNA的靶基因验证 虽然运用生物信息学的方法可以为研究人员提供大量的信息，且相对简单、快速，但是，它只是通过理论上的某种计算为研究人员提供某些参考信息，存在一定的局限性和可靠性，还需要通过生物实验方法进行验证。最直接的验证方法是，运用荧光定量聚合酶链反应及蛋白质印迹法检测转染miRNA后的细胞(组织)中信使RNA水平及蛋白水平，从而明确miRNA与靶基因的对应关系。近年来发展快速的荧光素酶报告基因法由于其快速、灵敏度高以及检测范围广，可以直接验证miRNA的靶位点。

1.7 miRNA的检测 目前已有多种方法检测miRNA，包括基因克隆、Northern blotting、原位杂交、反转录聚合酶链反应、微阵列芯片及高通量测序等技术。目前，大多数miRNA是通过反转录克隆识别和鉴定出来的，这是人们发现miRNA的一个重要方法;Northern blotting是最为经典的检测RNA的手段，也是目前检测miRNA表达水平的最主要方法，所有通过克隆和生物信息学分析得来的miRNA都应该经过Northern blotting来验证和鉴定;原位杂交是了解miRNA时间和组织特异性表达最常用的方法;反转录聚合酶链反应是一种可以定量分析miRNA表达水平的方式，也可用于验证生物学预测的miRNA;芯片技术的应用实现了在全基因组水平鉴定成熟miRNA的表达，分析同一细胞中不同的miRNA的差异性表达以及比较不同组织或细胞中miRNAs表达谱的差异，成为高通量检测的最佳选择;高通量测序能够在实验中发现新的小分子RNA，成功地检测到了基因芯片未发现的miRNA［29］。

2 miRNA的应用

由于miRNA在生命活动中表现出来的广泛调节功能以及对基因表达、生长发育和疾病发生、发展等的复杂效应，miRNA自被发现以来即成为生命科学的研究热点。生命科学研究已经进入后基因组时代，利用miRNA从分子水平来阐明生物体的生命活动过程，阐述物种的起源和生物的演化，来揭示生命的奥秘。基因表达具有时间和空间的特异性，不同物种、组织、细胞，在不同生理、病理状态下miRNA的表达情况不同，它们可能会成为用于诊断和(或)区分健康与疾病状态的潜在生物标志物［30］。目前，miRNA已经作为多种疾病的生物标志物［31-33］。此外，理论上，通过改变miRNA的空间结构，可以发现潜在的药物作用靶点;抑或采用miRNA模拟物、miRNA激动剂、miRNA抑制物以增加或降低病变组织或细胞的miRNA水平，从而下调或上调特异性靶蛋白的表达，开展基于miRNA的分子靶向治疗及个体化治疗方案［34］。

3 小结

在过去的研究中，人们已经了解了很多关于miRNA的特性及功能的知识，但对miRNA具有的所有特性和功能还缺乏全面的研究;而miRNA在生物体整体分子网络中扮演的角色的研究才刚刚开始。在未来的研究中，人们将会运用系统生物学方法来研究miRNA参与控制生物体的生长发育以及生物体在不同状态下的表达水平，对生物体的生命机制进行全面而系统地分析。相信随着研究的不断深入，这些研究成果必将会造福于人类。

［1］Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］.Cell，1993，75(5):843-854.

［2］Reinhart BJ，Slack FJ，Basson M，et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，2000，403(6772):901-906.

［3］Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs［J］.Science，2001，294(5543):853-858.

［4］Griffiths-Jones S，Hui JH，Marco A，et al.MicroRNA evolution by arm switching［J］.EMBO Rep，2011，12(2):172-177.

［5］Yang JS，Phillips MD，Betel D，et al.Widespread regulatory activity of vertebrate microRNA*species［J］.RNA，2011，17(2):312-326.

［6］Brameier M.Genome-wide comparative analysis of microRNAs in three non-human primates［J］.BMC Res Notes，2010，3:64.

［7］Sonntag KC，WooTU，KrichevskyAM.ConvergingmiRNA functions in diverse brain disorders:a case for miR-124 and miR-126［J］.Exp Neurol，2012，235(2):427-435.

［8］Swartling FJ，Bolin S，Phillips JJ，et al.Signals that regulate the oncogenic fate of neural stem cells and progenitors［J］.Exp Neurol，2014，260:56-68.

［9］Meza-Sosa KF，Pedraza-Alva G，Perez-Martinez L.microRNAs:key triggers of neuronal cell fate［J］.Front Cell Neurosci，2014，8:175.

［10］Gao FB.Context-dependent functions of specific microRNAs in neuronal development［J］.Neural Dev，2010，5:25.

［11］Castellano L，Stebbing J.Deep sequencing of small RNAs identifies canonical and non-canonical miRNA and endogenous siRNAs in mammalian somatic tissues［J］.Nucleic Acids Res，2013，41(5):3339-3351.

［12］He Z，Jiang J，Kokkinaki M，et al.MiRNA-20 and mirna-106a regulate spermatogonial stem cell renewal at the post-transcriptional level via targeting STAT3 and Ccnd1［J］.Stem Cells，2013，31(10):2205-2217.

［13］Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions［J］.Cell，2009，136(2):215-233.

［14］Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer［J］.Nat Rev Genet，2009，10(10):704-714.

［15］Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al.Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(24):15524-15529.

［16］Vincent K，Pichler M，Lee GW，et al.MicroRNAs，genomic instability and cancer［J］.Int J Mol Sci，2014，15(8):14475-14491.

［17］Li L，Luo J，Wang B，et al.Microrna-124 targets flotillin-1 to regulate proliferation and migration in breast cancer［J］.Mol Cancer，2013，12:163.

［18］Yamazaki H，Chijiwa T，Inoue Y，et al.Overexpression of the miR-34 family suppresses invasive growth of malignant melanoma with the wild-type p53 gene［J］.Exp Ther Med，2012，3(5):793-796.

［19］Musumeci M，Coppola V，Addario A，et al.Control of tumor and microenvironment cross-talk by miR-15a and miR-16 in prostate cancer［J］.Oncogene，2011，30(41):4231-4242.

［20］Barh D，Malhotra R，Ravi B，et al.MicroRNA let-7:an emerging next-generation cancer therapeutic［J］.Curr Oncol，2010，17(1):70-80.

［21］Gramantieri L，Ferracin M，Fornari F，et al.Cyclin G1 is a target of miR-122a，a microRNA frequently down-regulated in human hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2007，67(13):6092-6099.

［22］Akao Y，Nakagawa Y，Kitade Y，et al.Downregulation of microRNAs-143 and-145 in B-cell malignancies［J］.Cancer Sci，2007，98(12):1914-1920.

［23］Mardente S，Mari E，Consorti F，et al.HMGB1 induces the overexpression of miR-222 and miR-221 and increases growth and motility in papillary thyroid cancer cells［J］.Oncol Rep，2012，28(6):2285-2289.

［24］Ibrahim SA，Yip GW，Stock C，et al.Targeting of syndecan-1 by microRNA miR-10b promotes breast cancer cell motility and invasiveness via a Rho-GTPase-and E-cadherin-dependent mechanism［J］.Int J Cancer，2012，131(6):884-896.

［25］Pan X，Wang ZX，Wang R.MicroRNA-21:a novel therapeutic target in human cancer［J］.Cancer Biol Ther，2010，10(12):1224-1232.

［26］Di Leva G，Garofalo M，Croce CM.MicroRNAs in cancer［J］.Annu Rev Pathol，2014，9:287-314.

［27］Peterson SM，Thompson JA，Ufkin ML，et al.Common features of microRNA target prediction tools［J］.Front Genet，2014，5:23.

［28］夏伟，曹国军，邵宁生.MicroRNA靶基因的寻找及鉴定方法研究进展［J］.生命科学，2009，39(1):121-128.

［29］Baker M.MicroRNA profiling:separating signal from noise［J］.NatMethods，2010，7(9):687-692.

［30］Ebert MS，Sharp PA.Roles for microRNAs in conferring robustness to biological processes［J］.Cell，2012，149(3):515-524.

［31］Ohyashiki K，Umezu T，Yoshizawa S，et al.Clinical impact of down-regulated plasma miR-92a levels in non-Hodgkin's lymphoma［J］.PLoS One，2011，6(2):e16408.

［32］Cheng H，Zhang L，Cogdell DE，et al.Circulating plasma MiR-141 is a novel biomarker for metastatic colon cancer and predicts poor prognosis［J］.PLoS One，2011，6(3):e17745.

［33］Zhou SL，Wang LD.Circulating microRNAs:novel biomarkers for esophageal cancer［J］.World J Gastroenterol，2010，16(19):2348-2354.

［34］van Rooij E，Kauppinen S.Development of microRNA therapeutics is coming of age［J］.EMBO Mol Med，2014，6(7):851-864.