韦国建 , 刘文广 林坚士 何毛贤

(1. 中国科学院 热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东省应用海洋生物学重点实验室, 中国科学院 南海海洋研究所, 广东 广州 510301; 2. 中国科学院大学, 北京100049)

水产养殖动物的多数重要经济性状例如生长、抗逆和肉质等都是数量性状, 不仅由多个基因控制,且易受环境等因素的影响[1]。挖掘数量性状位点(Quantitative trait locus, QTL)的最终目的是利用与目标性状紧密连锁的分子标记进行分子标记辅助选择育种(marker-assisted selection, MAS), 从而促进对性状的遗传改良[2]。目前遗传连锁图谱构建和 QTL定位在水产养殖动物中取得了较大的进展, 但是这些QTL一般是基于单个家系小样本量作图获得的,QTL区间过大, 导致QTL的检测效率和对QTL效应的评估发生偏离[3]。因此对挖掘到的 QTL作进一步的验证和鉴定是实施MAS的前提。QTL验证最简单的方法是比较QTL位点不同等位基因的表型差异[3-4]。目前对 QTL定位结果进行验证的报道还不是很多,在尖吻鲈[5]、虹鳟[6-8]、鲤鱼[9-11]、大西洋鲑鱼[12]和牙鲆[13-14]等少数鱼类的生长和抗病 QTL进行了确认,并且已有少数QTL结果应用于指导实践育种[12,14-16]。而在海洋贝类, 还极少见对 QTL进一步验证和应用的报道。

马氏珠母贝(Pinctada martensii)是重要海水养殖贝类。最近, 利用遗传图谱获得了与其生长性状连锁的QTL标记, Shi等[17]应用2b-RAD测序技术, 利用3117个SNP标记构建了马氏珠母贝遗传图谱, 获得6个与总重、壳长、绞合线和珍珠层厚度相关的QTL。Li等[18]利用 RAD测序构建遗传图谱获得与马氏珠母贝壳高、壳长、壳宽、壳重、软体部重、绞合线和总重7个生长性状连锁的QTL。但目前还没有对这些QTL作进一步的验证和应用。本研究用2个不同遗传背景的马氏珠母贝群体对其中两个QTL(154165和 m59)进行验证, 评估 QTL不同基因型与生长性状的相关性, 旨在获得真实稳定的 QTL结果, 为开展基于QTL结果的MAS奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验群体

本实验所用的马氏珠母贝(Pinctada martensii)来自深圳养殖群体(211只)和湛江养殖群体(111只), 均为2贝龄, 来源于同期贝苗, 养殖于深圳大鹏澳海区,以同样的管理条件及相同的养殖密度进行养殖。用游标卡尺测量并记录每只贝的壳高、壳长和壳宽, 精确到0.01 mm; 用电子天平称量每只贝的总重, 精确到0.01 g。分别取每只贝的鳃组织置于95%的乙醇中,–20℃保存。

1.2 基因组DNA的提取

使用 DNA提取试剂盒(Hipure Universal DNA Kit)提取鳃组织的基因组 DNA, 相关操作参照试剂盒说明书。提取DNA后, 于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性; 并用分光光度计检测其纯度及浓度。提取的DNA于–20℃保存。

1.3 引物设计

已获得的 QTL连锁标记所在的序列为短序列,其长度无法用来设计引物。因此以连锁标记的序列为源序列, 在已公布的马氏珠母贝基因组草图(http://marinegenomics.oist.jp/)和本实验室已有的马氏珠母贝转录组数据库中进行Blast比对, 找出与之匹配的序列。根据匹配的序列和QTL标记SNP位置, 利用Primer Primer5.0软件和Tetra-primer ARMS在线引物设计程序(http: //primer1.soton.ac.uk/primer1.html)设计每个 QTL标记 SNP基因分型的特异引物(表 1)。

表1 QTL位点SNP分型引物Tab.1 Primer used for analysis of QTL in pear oyster Pinctada martensii

1.4 PCR扩增

采用等位基因特异 PCR(AS-PCR)法对样品的QTL标记SNP进行基因分型。15 µL的PCR反应体系为: 1.5 µL10×PCR buffer, 1.5 µL dNTP Mixture(各2.5 mmol/L), 0.15 µLTaq DNA 聚合酶(5 U/µL), 1µL内 引 物(10 µmol/L), 0.5µL 外 引物(10 µmol/L),0.5 µLDNA, 8.35 µL ddH2O。反应程序为: 94℃预变性4 min; 94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s,30个循环; 最后 72℃延伸 5min。PCR反应产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 统计分析

用 SPSS19.0软件中一般线性模型(GLM)进行QTL连锁标记SNP及其二倍型与马氏珠母贝生长性状的关联性。采用Duncan,s多重比较分析各基因型、二倍型差异的显著性, 差异显著为P<0.05。方差分析的数学模型为:Yij=u+GiorDi+eij, 其中Yij表示基因型为i的第 j个个体的指标,u表示总体均值,Gi表示第i种基因型的效应,Di表示第i种二倍型的效应eij表示随机误差变量。

2 结果与分析

2.1 QTL连锁标记与生长性状的验证

m59和154165QTL标记在湛江养殖群体和深圳养殖群体中都可检测出3种基因型。经SPSS19.0软件的一般线性模型(GLM)分析, m59标记在湛江群体中与壳高、壳长、壳宽和总重关联显著(P<0.05)(表2),其中GT基因型的壳高、壳长、壳宽和总重显著高于GG 基因型的个体, 分别高出 8.9%、5.63%、8.09%和21.38%(表3); 在湛江群体中进行验证也得到类似的结果, 该位点与壳高、壳长、壳宽和总重4个生长指标关联显著(P<0.05)(表2), 其GT基因型的个体的壳高、壳长、壳宽和总重比 GG基因型个体分别高出10.95%、11.41%、11.90%和26.67%(表3)。

154165位点在湛江群体中与壳高关联显著(P<0.05)(表2), GG、AG基因型的个体壳高均值显著高于基因型为 AA的个体, 分别高出 9.24%和5.87%(表 3); 而在深圳群体中与壳高关联不显著(P>0.05), 却与壳宽关联显著(P<0.05)(表2), GG基因型的个体壳宽均值显著高于AG和AA基因型的个体, 分别比 AG和 AA基因型个体高 17.14%和18.06% (表 3)。

2.2 QTL连锁标记SNP二倍型构建及生长性状的关联分析

为了进一步研究这两个QTL连锁标记SNP与生长性状的整体作用, 基于这两个QTL在这2个群体分别构建二倍型。统计分析发现, 在湛江群体中, 虽然二倍型C1型(AAGT)和C2型(GGTT)在壳高、壳长和总重显著高于C5型(AAGG), 但由于二倍型C2在壳宽与二倍型C5没有显著性差异, 因此二倍型C1对马氏珠母贝的生长最为有利(表 4); 在深圳群体中, 统计分析发现这5种二倍型与马氏珠母贝的壳高、壳长、壳宽、总重关联显著(P<0.05), 二倍型为 D1(AGGT)和D2(AAGT)型的马氏珠母贝在4个生长性状指标显著高于D4(AAGG)和 D5(GGTT)型(P<0.05), 二倍型 D1(AGGT)和D2(AAGT)的 4个生长性状没有显著差异(P>0.05), 且个体最大, 可作为优选的基因型组合(表4)。

表2 马氏珠母贝QTL连锁标记与生长性状的GLM分析Tab.2 Association analysis of QTL and growth traits in Pinctada martensii using GLM

表3 马氏珠母贝2个QTL位点不同基因型多重比较Tab.3 Multiple comparison of growth traits in Pinctada martensii at two QTL loci

表4 QTL连锁标记SNP二倍型与马氏珠母贝生长性状的关联分析Tab.4 Associations between diplotypes of QTL and growth traits in Pinctada martensii

3 讨论

目前, 虽然开展了遗传连锁图谱构建及QTL定位的水产养殖动物多达几十种, 但是将 QTL结果应用于遗传改良中的研究还是较少[19], 比较典型的成功例子是牙鲆抗病淋巴囊肿病(LD)、大西洋鲑鱼抗传染病胰腺坏死病(IPN)的辅助选育中[12,14]。相对于抗病相关的 QTL结果, 生长性状更容易受到环境因素的影响, 具有数量性状的遗传特征, 在一个群体或者家系中定位到的QTL可能不适用于另一个家系或者群体。因此如何验证这些 QTL, 进而利用与性状紧密连锁的QTL标记进行性状的遗传改良将是下一个阶段的研究重点。

研究表明, 用不同遗传背景、不同发育阶段以及不同养殖环境的群体或者家系获得的QTL间存在共享 QTL和特异 QTL。Rexroad等[20]在虹鳟 Omy16连锁群上定位到1个皮质醇浓度连锁的极显著QTL区间, 同时发现与 3个虹鳟家系的皮质醇浓度具有相关性, 而与另外 4个家系的皮质醇浓度不相关;Laghari等[21]定位到与鲤鱼3个不同阶段体重相关的QTL, 在第6连锁群上的1个QTL与3个阶段的体重都相关的 QTL, 而不同阶段也有特异的 QTL存在。Wang等[5]在2个不同遗传背景的群体中对生长性状QTL进行验证, 发现连锁群LG2上的QTL标记 Lca371在 2个群体中与体重具有显著的相关性,而其他QTL仅在一个家系表现出与性状的相关性。本文使用 2个不同遗传背景的马氏珠母贝群体对154165和m59标记进行验证, 发现m59标记在这2个群体中为共享QTL, 且该位点的GT基因型个体的生长性状(壳高、壳长、壳宽和总重)显著高于GG基因型的个体, 为马氏珠母贝生长优势基因型, 而154165标记为特异 QTL, 即在湛江群体中与壳高相关性显著, 在深圳群体中与壳宽相关性显著。这一结果与 Wang等[5]验证尖吻鲈的 QTL结果类似。这 2个QTL的效应大小在2个群体中不一样的原因可能是不同遗传背景下QTL的等位基因频率不相同。出现这些特异的 QTL 的原因可能是生长性状受到QTL间的上位性效应的影响[22]以及QTL和环境互作的影响。在鸡的下颌骨研究中也发现QTL间的上位性互作效应对生长性状的表型值具有重要的作用[23]。

Shi等[17]在 6个生长性状中定位到的 m59只与珍珠层厚度相关, Li等[18]定位到的QTL154165与总重和壳重相关, 虽然有一些性状指标在本研究中没有检测, 但在本研究中显著关联的性状仍与这两篇文献的报道存在一定的差异。造成这种差异的原因可能是: 定位到的这些 QTL一般是通过特定家系作图获得, 获得的 QTL结果可能不适合用于另一个家系或者群体; QTL作图时在LOD临界值下错误的判断有 QTL存在而出现假阳性; 表型分型不够准确也会增加实验误差。孙效文等建议将QTL结果应用育种之前最好在大样本量的随机群体中进行验证, 以增加QTL在育种群体中的利用价值[24,25]。本文利用2个不同遗传背景的群体对通过遗传图谱获得的马氏珠母贝生长性状QTL进行验证, 对实施MAS有着重要的意义。

单独的SNP标记进行性状关联分析提供的信息往往是有限的, 通过构建二倍型可以提供更丰富的遗传信息来弥补单独 SNP 的缺陷[26-28]。García- Magariños 等[29]发现人类一些复杂疾病可能与SNP-SNP相互作用有关; 在鲤鱼IGF-I基因中的单个 SNP位点 g.7722T>C与生长性状关联不显著(P>0.05), 但是当SNP g.7627T>A和g.7722T>C结合时, 发现二倍型(TTTT)个体的体重、体长和 K值均显著小于其他二倍型(P<0.01)[30]; Cong等[31]研究长牡蛎IRR基因上的2个SNP标记构建的5个二倍型中, 发现二倍型D3(GGTT)是对长牡蛎的生长最为有利。在本研究中, 基于2个QTL连锁标记SNP分别在湛江和深圳群体中构建二倍型, 发现二倍型(AAGT)在湛江和深圳群体中对马氏珠母贝的生长最为有利的基因型组合。这一结果表明m59位点的GT基因及与其他位点基因型结合可能有利于马氏珠母贝的生长。此外, 在深圳群体中二倍型D1(AGGT)也是对马氏珠母贝生长最为有利的二倍型之一, 而在湛江群体中没有出现此二倍型类型的个体, 出现这种现象的原因可能有用验证的两个群体的数量大小有差异, 从而引起等位基因频率在不同的群体中不一样, 基因型组合的类型也不一样;群体间存在特异QTL也是原因之一。

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