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重组抗CD52人源化单克隆抗体ELISA检测方法的建立

2015-11-29李金龙胡百卉许先兴张代超刘运龙陈知航程远国

生物技术通讯 2015年5期
关键词:人源单克隆单抗

李金龙 ,胡百卉,许先兴,张代超,刘运龙,陈知航,程远国

1.吉林农业大学 动物科技学院,吉林 长春 130062;2.军事医学科学院 微生物与流行病研究所,北京 100071;3.第二炮兵总医院 药学部,北京 100088

慢性B 淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是一种B 淋巴细胞克隆性增殖的肿瘤性白血病,特点为血液、骨髓和淋巴组织中大量单克隆的成熟小B 淋巴细胞的增殖[1]。CLL 在西方国家是最常见的成人白血病类型,在亚洲国家少见[2]。

CD52 是细胞表面的一种相对分子质量为21×103~28×103的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol,GPI)锚定糖蛋白抗原,但去掉糖基后它的相对分子质量只有8×103~9×103[3]。成熟CD52 的蛋白结合部分仅含12 个氨基酸残基(GQNDTSQTSSPS),C 端通过GPI 锚定分子连接于细胞膜表面,N 端3 位天冬酰胺残基连接有一个复杂的糖基,在其四角岩藻糖基化的甘露糖核心上有几个唾液酸化的多聚乳糖胺单位[4-6]。CD52分布比较广泛,一般表达于正常及恶性的B 和T 淋巴细胞、NK 细胞、单核细胞、巨噬细胞表面及男性的生殖系统组织中[7]。多个志愿者来源的样本分析表明CD52 不表达于红细胞与造血干细胞[8]。

Campath 是一种抗CD52 的单克隆抗体,通过哺乳动物细胞(CHO)悬浮培养制备而得,为IgG1 亚型,具有人类抗体可变区的框架区及恒定区和鼠单克隆抗体(Campath-1G)互补决定区,相对分子质量约为150×103。Campath 作为一种抗CD52 的单克隆抗体,能特异地识别表达在所有淋巴细胞和单核细胞表面的CD52 抗原,并与之结合杀伤淋巴细胞[9],其作用机制可能包括与白血病细胞表面的CD52 抗原结合后直接诱导凋亡、通过补体介导的细胞毒作用杀伤靶细胞(CDC 作用),以及抗体依赖的溶细胞作用杀伤靶细胞(ADCC 作用),从而达到治疗相关疾病的目的。

目前已报道的检测血清中抗CD52 单克隆抗体的方法很多,多数为ELISA,其他方法还有免疫荧光法、细胞放射免疫法等。但这些方法存在检测复杂、耗时长、灵敏度低等问题,如ELISA 的定量限(LOQ)为0.5~6.6 μg/mL,流式细胞法的LOQ 为0.1~1 μg/mL[10]。在本研究中,我们拟于建立一种灵敏、特异、快速的双抗夹心ELISA 法,用于检测食蟹猴血清中抗CD52 单克隆抗体的浓度。我们采用的包被抗体与检测抗体都是猴血清吸附的羊抗人IgG,此多抗既可捕获又可用于检测抗CD52单克隆抗体,而且该多抗是经过猴血清吸附特殊处理过的,这样可以将与猴IgG 结合的那部分羊抗人IgG 除去。这种测定方法的灵敏度、准确性和特异性都非常高,并可成功地用于支持抗CD52 单克隆抗体临床前动物试验研究的药代动力学分析。

1 材料和方法

1.1 材料

重组抗CD52 单克隆抗体体注射液(HS020)由浙江海正药股份有限公司提供,浓度为30 mg/mL,于4℃保存;猴血清吸附的羊抗人IgG(1 mg/kg)、猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP(1 mg/kg)购于Bethyl公司;牛血清白蛋白(BSA)购于罗氏公司;CHAPS购于Sigma 公司;Proclin300 购于Supelco Analytical 公司;四甲基联苯胺(TMB 显色液)购于Aladdin 公司;聚苯乙烯96 孔酶标板购于Costar 公司;酶标仪购于BIO-RAD公司;其他常规试剂为国产分析纯产品。

试剂配制:①pH7.4 磷酸盐缓冲液(PBS):称取16 g NaCl、0.4023 g KCl、2.84 g Na2HPO4、0.544 g KH2PO4,溶解于2 L ddH2O,pH7.4;②包被液:取0.2 mol/L 碳酸钠水溶液16 mL 和0.2 mol/L 碳酸氢钠水溶液34 mL,加蒸馏水至200 mL;③封闭液:PBS,2% BSA,0.05% P20,0.05% Proclin300,0.25% CHAPS,5 mmol/L EDTA,0.35 mol/L NaCl,pH8.0,总体积200 mL;④稀释液:PBS,0.5% BSA,0.05% P20,0.05% Proclin300,0.25% CHAPS,5 mmol/L EDTA,0.35 mol/L NaCl,pH8.9,总体积200 mL;⑤TMB 显色液:将A 液与B 液等体积混合,现用现配;⑥终止液(1 mol/L 硫酸):将10.4 mL 硫酸(98%)缓慢加入189.6 mL 蒸馏水中,边加入边搅拌,总体积200 mL;⑦ELISA 洗板液:将0.5 mL Tween-20加入999.5 mL磷酸盐缓冲液中;⑧标准曲线溶液:先将重组抗CD52 单克隆抗体稀释至500 ng/mL,之后再梯度稀释至7.81 ng/mL。

1.2 检测步骤

①包被:用pH9.6 的碳酸盐缓冲液包被猴血清吸附的羊抗人IgG 单克隆抗体,稀释至5 μg/mL,100 μL/孔,4℃过夜;②封闭:用洗液洗板3 次,拍干酶联板,加封闭液200 μL/孔,室温封闭2 h;③加样:用洗液洗板4 次,拍干酶联板,用20%的食蟹猴空白血清稀释不同浓度的标准品和待测样品,每孔加100 μL,室温孵育1 h;④加二抗:用洗液洗板6次,拍干酶联板,每孔加100 μL 猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP(1∶40 000 稀释),室温孵育1 h;⑤显色:用洗液洗板6次,拍干酶联板,加1∶1混合的TMB显色液A、B 液,100 μL/孔,室温孵育15 min;⑥终止:加终止液100 μL/孔,30 min 内读数;⑦比色:分别读取D450nm和D560nm值。

2 结果

2.1 标准曲线与线性范围

将重组抗CD52 单克隆抗体用20%猴血清稀释至500、250、125、62.5、31.25、15.63 及7.81 ng/mL,取100 μL 样品,依据上述步骤检测。以D值为纵坐标、各标准管浓度为横坐标,对其进行非线形回归运算。测得重组抗CD52 人源化单克隆抗体在7.81~500 ng/mL 范围内,蛋白浓度(ng/mL)的对数值与免疫反应光吸收(D值)呈S 状形曲线,经四参数Logistic 函数曲线模型拟合,求得曲线斜率、EC50,及上下端渐进线间的近线性范围。拟合曲线见表1 和图1。其数学模型为:

2.2 方法的灵敏度与最低检测浓度

按照制备标准曲线的方法制成7.8 ng/mL 的重组抗CD52人源化单克隆抗体,同样按上述方法进行测定,重复6 次,由同一板上的标准曲线回归方程计算出的浓度为抗CD52 单抗检出量。最低定量下限满足方法学要求,CV为4.9%,RE为+10.8%,确定检测的最低定量下限为7.8 ng/mL。

2.3 方法的精密度与准确度

同样按上述方法测定400、62.5、15.6 ng/mL 高、中、低三种浓度,每个浓度平行测定6 次,共测定3次,分别计算批内与批间的CV值与RE值。结果显示在高、中、低三种浓度水平下测定的批内与批间CV值均小于10%,说明检测方法具有较高的精密度;批内与批间的RE值均小于10%,说明检测方法具有较高的准确度。

2.4 方法的回收率

按照制备标准曲线的方法制成400、62.5、15.6 ng/mL(高、中、低)三个浓度的受试品重组抗CD52人源化单克隆抗体的质控样品,同样按上述方法进行测定,重复6 次,由同一板上的标准曲线回归方程计算出的浓度为重组抗CD52 人源化单克隆抗体的检出量。

2.5 方法的特异性

分别做PEG-EPO(促红细胞生成素)、IL-2(白细胞介素2)、GH(生长激素)和受试品抗CD52 单抗的校正标准曲线,结果表明抗CD52单抗没有与前三者发生交叉反应(图2)。

图1 重组抗CD52人源化单克隆抗体的四参数校正曲线

图2 受试品CD52与PEG-EPO、GH、IL-2的校正曲线

2.6 样品的稳定性

从标准曲线选取高、中、低三个浓度的质控样品,每个浓度6 个样本,在-20℃冰箱中冷冻后取出,室温融化,反复3 次,测定其浓度,确定冻融稳定性;室温保持4 h 后,测定其浓度,确定室温稳定性;4℃冰箱中放置24 h后,测定其浓度,确定4℃24 h短期稳定性;-80℃冰箱中冷冻120 d 后取出,室温融化,测定其浓度,确定长期稳定性。结果表明,重组抗CD52 单克隆抗体在血清中冻融3 次、室温放置4 h、4℃冰箱中放置24 h、-80℃长期保存均不影响其稳定性。

2.7 样品稀释率的影响

将重组抗CD52 单克隆抗体稀释至100 μg/mL后,分别进行1/250、1/1600、1/6400 稀释,每个浓度6个复孔进行测定,结果见表6,各稀释率对样品检测无影响,不存在稀释效应。

2.8 小结

上述方法学确证结果表明,本研究建立的方法的特异性、板内和板间精密度、最低定量下限、回收率、稳定性及样品稀释率的影响均满足生物样品分析要求,可用于重组抗CD52单克隆抗体的药代动力学研究。

表1 标准曲线与线性范围

表2 ELISA检测加入猴血清中受试物的抗体的灵敏度

表3 ELISA检测加入猴血清中受试物的抗体的精密度与准确度

表4 ELISA检测加入猴血清中受试物的抗体的回收率

表5 重组抗CD52人源化单克隆抗体的稳定性

表6 样品稀释率的影响

3 讨论

检测生物样本中重组抗CD52 单克隆抗体的方法很多,但各有优缺点。抗体依赖细胞毒性(ADCC)法的灵敏度较高,检测抗体浓度可达0.01 μg/mL 以下,但此方法需用新鲜血作为效应细胞,而供血者之间的差异很难使检测方法标准化,也很难保证方法的精确度。补体介导细胞毒(CDC)法的优点是供血者之间补体变化不大,可获得大量试验用血清,但血清中补体抑制因子变异较大,当血清浓度过高时可抑制CDC 反应,因此在检测时必须尽量稀释血清样品,或在加入血清样品和补体过程中增加清洗步骤,因而检测灵敏度大大降低。放射免疫法是将人的T细胞固定在微孔板上,加入稀释的重组抗CD52单克隆抗体或待测血清,然后加入放射性标记的重组抗CD52 单克隆抗体,检测灵敏度较高,可达0.1 μg/mL,但中和抗体的出现会严重干扰试验结果。免疫荧光法功能强大,无论是灵敏度、精密度还是准确度都能满足检测需求,检测CD52单抗的最低检测限可达0.5 μg/mL,但流式细胞检测方法相对复杂,并且耗时较长,该方法的一个特点是只有具有抗原结合位点和Fc 片段的生物活性抗体才能被检测,已通过突变结合位点试验加以证明,潜在的干扰是靶细胞与人血清中正常的IgG 及其他人抗体结合。ELISA法检测治疗性单克隆抗体可用重组抗原或抗独特型抗体捕获待检抗体,但实际上如果没有特异性的捕获抗体和检测抗体,那么抗CD52单抗必然会与正常猴IgG 发生交叉反应,且使本底值升高,灵敏度下降,其检测灵敏度为0.06~6.6 μg/mL,这就是ELISA灵敏度不高的原因。

综上所述,为了提高检测灵敏度,缩短检测时长,使检测方法更便捷,我们研究了一种生物分析药代动力学测定法——双抗夹心ELISA,用于检测食蟹猴血清中抗CD52 单克隆抗体的浓度。此方法不依赖于抗CD52单抗的特异性,包被抗体和检测抗体都是羊抗人IgG,该抗体既可用于捕获又可检测抗CD52抗体,且经猴血清吸附过后可排除猴血清成分的干扰,提高测定的特异性、准确性和灵敏度。因为此方法是以人IgG 为特异性的,而不仅仅是以抗CD52 单抗为特异性的,所以该法的应用性更广泛,不仅可支持抗CD52 单抗猴实验研究的药代动力学分析,同时也可测定非灵长类和啮齿类动物血清中的人IgG 或人源化IgG 分子,如Cetuximab(西妥昔单抗)、Trastuzumab(曲妥珠单抗)等。但是,当动物被给予多种人源化单抗时,此检测方法只能检测出生物体内总的单抗水平,无法得出单一单抗水平。

总之,应用此方法,我们可以快速、准确地检测出食蟹猴血清中人源化IgG,而无须特异性试剂。

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