沈江涛，段学辉，郑希帆，张倩，牛书操

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 食品学院，江西 南昌 330047）

稻草生物质的预处理及其发酵产酶与酶解效果研究

沈江涛，段学辉，郑希帆，张倩，牛书操

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 食品学院，江西 南昌 330047）

采用稀酸、稀碱、高温稀碱、亚硫酸盐法（SPORL法）和稀酸-亚硫酸盐法（稀酸SPORL法）对粉碎稻草秸秆预处理，考察不同预处理方法对稻草基质多菌发酵产纤维素酶的影响，分析预处理前后稻草基质主要成分的变化，酶水解液中糖组分的含量。结果表明：稀酸SPORL法处理的稻草粉在固态发酵产酶和酶解糖化都具有较好的效果，所得羧甲基纤维素酶（CMCase酶）和β-葡萄糖苷酶（β-G）比酶活分别达到21 511.22和51 508.41 U/g，同时酶水解率达到84.99%。除SPORL法外，其他预处理方式所得酶活均出现了不同程度的下降。稀酸预处理对稻草基质中的半纤维素去除效果较好，含量由20.77%下降到7.34%；稀碱高温处理对木质素脱除效果较好，Klason木质素含量由12.47%下降到7.58%。通过酶解糖化实验发现，未处理稻草粉酶水解率仅为17.82%，稀碱高温法效果最好，稻酶水解率达到91.66%。稀酸和稀酸SPORL法处理后，稻草粉基质的酶解糖化液中，戊聚糖占总糖相对含量较低，分别为7.38%和6.92%。

纤维素酶；混合菌发酵；预处理；SPORL；酶解糖化

纤维素是自然界中十分丰富的资源，如麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的来源［1］。将生物质转化为乙醇需经过一系列复杂的工艺，主要包括原料预处理、（半）纤维素酶水解和戊糖己糖发酵等步骤。其中纤维素酶水解的成本占整个转化工艺的60%［2］。由于生物质中木质素对纤维素的包覆作用及其刚性结构，使得酶水解效果不理想，所以预处理是酶水解生物质原料和制取生物乙醇的必经过程［3］。采用何种有效的预处理技术来破坏生物质中纤维素的结晶结构，增加纤维素酶的可及性和提高酶解产糖率是该领域主要的技术难点［4-8］。纤维素酶固态发酵具有成本低、产出高、耗能低等优势。合理的预处理方式不仅要考虑酶解糖化阶段提高酶水解率，还应有利于微生物发酵生产纤维素酶，如许宪松等［9］研究报道，经过微波、超声波处理的稻壳生物质能够得到微生物更好的利用和发酵产酶，同时也有着较好的酶水解效果。一种合理的预处理方式将固态发酵产酶和酶水解糖化整合在一起，在降低经济成本和资源的合理利用中，具有着重要的意义。

本研究中，笔者采用稀酸、稀碱、稀碱高温、亚硫酸盐法（SPORL法）和稀酸SPORL方法对稻草生物质进行预处理，将处理前后的原料进行三菌固态发酵产酶及酶解糖化，以期探索出一种合理的、适于广泛应用的预处理方法，以获得高活力纤维素酶，同时又能提高底物的酶水解糖化效果，从而为稻草秸秆预处理工艺的改进及高效转化利用打下实验基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

发酵菌为白腐菌White-rot fungi NS75，黑曲霉Aspergillus niger NS83和絮凝酵母 Saccharomyces cerevisiae SP5，筛选保藏于笔者所在实验室。白腐菌和黑曲霉移接在马铃薯、琼脂斜面上，絮凝酵母接在YEPD、琼脂斜面上，30℃下培养3 d后，于冰箱中保存备用。

1.2 试剂

葡萄糖、尿素、肌醇、（NH4）2SO4、H2SO4、NaOH、MgSO4·7H2O和KH2PO4均为分析纯；酵母浸粉、牛肉膏和蛋白胨均为生物试剂。

稻草取自南昌市郊区蒋巷乡稻田，烘干、粉碎保存，麸皮为市售。

纤维素酶：采用实验室多菌固态发酵制得的纤维素酶，CMCase糖化酶活力，纤维二糖酶活力分别为30、62 U/mg。

1.3 培养基

PDA培养基（g/L）：葡萄糖20，琼脂20，马铃薯100。

固体发酵培养基：将8 g经过预处理的稻草粉、2 g麸皮和20mL Mandels营养液混合。

Mandels［10］营养液（g/L）：KH2PO42.0，（H2N）2CO 0.3，ZnSO4·7H2O 0.001 4，CaCl20.3，MnSO4·H2O 0.001 6，MgSO4·7H2O 0.3，（NH4）2SO41.4，FeSO4· 7H2O 0.005，CoCl20.002。

1.4 原料预处理

1.4.1 稀酸预处理

粉碎过孔径0.60 mm筛网的稻草粉，与质量分数0.5%、1%和2%的H2SO4溶液均匀混合，固液比设定为1∶5（g/mL），于130℃下反应60min。

1.4.2 稀碱预处理

粉碎过孔径0.60 mm筛网的稻草粉，与质量分数2%、3%和4%的NaOH溶液均匀混合，固液比设定为1∶5（g/mL），于26℃常压处理24 h，再于110℃下反应30min。

1.4.3 稀碱高温预处理

将粉碎过孔径0.60 mm筛网的稻草粉先于140℃蒸汽处理5 h，再与质量分数3%的NaOH溶液混合，固液比设定为1∶5（g/mL），于室温26℃常压处理24 h，再于130℃下反应30min。

1.4.4 SPORL法预处理

取粉碎过孔径0.60 mm筛网稻草50 g，与质量分数4%、8%和12%Na2SO3混合，固液比设定为1∶5（g/mL），将料液充分混合后升温至130℃，保温1 h完成Na2SO3预处理。

1.4.5 稀酸SPORL法预处理

取粉碎过孔径0.60 mm筛网稻草粉50 g，预处理液为0.5%H2SO4和8%Na2SO3，固液比设定为1∶5（g/mL），将料液充分混合后升温至130℃，保温1 h完成预处理。将经过预处理的稻草粉原料过滤收集，用固液比1∶15（g/L）的蒸馏水分5次洗涤、抽滤后，自然晾干，称质量计算预处理回收率，于保鲜袋中储藏。

1.5 预处理稻草粉原料固态发酵产酶

种子培养：将在试管斜面培养基上培养3 d的黑曲霉菌、白腐菌和絮凝酵母菌分别制成孢子或细胞悬浮液，各取1mL分别接于50mL液体种子培养基中，于30℃、200r/min培养24 h。

固态发酵产酶培养：10 g固体发酵培养基中接入总量为6mL的种子培养液，其中白腐菌、黑曲霉和絮凝酵母按1∶2∶1.5的体积比接种，然后搅拌均匀，30℃恒温培养7 d（絮凝酵母于黑曲霉、白腐菌接入生长48 h后接种），检测纤维素酶酶活。

1.6 预处理稻草粉原料的酶解糖化

分别准确称取1 g（干质量）稀酸预处理、稀碱预处理、稀碱高温预处理、SPORL法预处理和稀酸SPORL法处理的稻草粉原料，加入装有20mL pH 5.0的柠檬酸缓冲液的50mL三角瓶中，1 g底物添加一定量纤维素酶（50 mg），于50℃恒温水浴振荡器中，180r/min转速条件下酶解糖化，酶解60 h后离心分离，取上清液（糖化液）进行糖浓度分析。

1.7 测定酶活及组分分析检测

1.7.1 CMCase酶活测定

CMCase酶活测定参照文献［11-12］。取1mL的粗提酶液加入到2mL羧甲基纤维素钠（CMCNa）溶液中，50℃水浴保温反应30min，再用DNS法测定还原糖含量。

β-G酶活测定方法参照文献［13-14］。取1mL的粗提酶液加入到2mL 1%的水杨苷柠檬酸缓冲液中，50℃水浴保温反应30min，采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖含量［15］。

酶活单位定义：在一定反应条件下，1min水解底物生成1μg葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位，换算成每克干物料含有的酶活，以U/g表示。

1.7.2 预处理前后稻草粉成分分析

分别取处理前后的稻草粉，采用凡式法（VanSoest法）［16-17］对样品中的纤维素、半纤维素和木质素质量分数进行测定。

式中：w（NDF）为中性洗涤纤维质量分数，w（ADF）为酸性洗涤纤维质量分数，w（ADL）为酸不溶木质素质量分数，w（AIA）为灰分质量分数。

1.7.3 稻草粉酶解液中糖含量测定

稻草粉酶解后酶解液中还原糖浓度采用DNS法进行测定［15］。

戊聚糖浓度采用间苯三酚法（Douglas法）显色法测定［19］

戊聚糖相对含量=酶水解液中戊聚糖质量/酶水解液中还原糖总质量。

2 结果与讨论

2.1 预处理后原料组成成分变化

稻草粉经过不同预处理方法处理后，主要组成成分的含量分析结果如表1所示。

表1 不同预处理后稻草组分分析Table 1 Chemical composition of pretreated rice straw by various methods %

从表1可以看出：经过预处理的稻草粉原料半纤维素含量都有所降低。稀酸、稀碱和SPORL法预处理后的基质中，半纤维素含量都随处理浓度的增加而减少，其中酸处理对半纤维素的溶出效果最为明显，这和张木明等［20］的研究结果类似。2%稀酸处理下，基质中半纤维素含量相比对照组下降了64.7%；稀碱处理则主要削弱稻草粉基质中纤维素、半纤维素间的氢键，皂化木质素和半纤维素的酯键，在半纤维素的溶出效果上逊于稀酸处理。而稀酸SPORL法处理也有较好的半纤维素溶出效果，处理后基质中半纤维素含量下降到13.09%。

酸不溶木质素又称Klason木质素，是由Klason提出的用于表征木质素含量的指标。从表1中可以看出，稀碱、稀碱高温、SPORL法处理的基质中木质素含量都有下降，而稀酸和稀酸SPORL法处理的基质中，木质素含量则上升。Torget等［21］研究认为，在酸处理作用下，木质素会发生聚合作用而形成改性的木质素。碱法预处理的主要目的是去除基质中木质素，提高稻草粉原料中纤维素多聚糖的降解可及性。从表1中也可以看出：高温稀碱对Klason木质素的溶出效果较好，处理后原料中剩余的Klason木质素减少了约 40%；SPORL法和稀酸SPORL法处理的结果有些不同，因为稀酸SPORL法以脱除木质素、分离部分半纤维素和保留纤维素为主要目的，而SPORL法的目的则是水解溶出半纤维素，磺化、溶出部分木质素，保留纤维素并增强原料可水解性。同时，SPORL法处理过程中，随着Na2SO3用量增大，促进了木质素的磺化反应，木质素大分子上引入更多亲水性的磺酸基，增强木质素的溶出。

从表1中还可以看出：经过预处理的稻草粉基质中，纤维素相对含量都有所上升。稀酸和SPORL法预处理的基质中，纤维素的含量随处理液浓度增加而上升；3%质量分数稀碱处理时，基质中纤维素的质量分数相对较高，其中稀碱高温和12%亚硫酸盐预处理效果较好，处理基质中纤维素的质量分数分别达到49.01%和49.91%。

2.2 预处理方式对稻草粉固态发酵产酶的影响

将不同预处理方法处理的稻草粉作为多菌固态发酵的培养基，白腐菌、黑曲霉和絮凝酵母按体积比1∶2∶1.5接种，接种总量保持在每10 g培养基中接种6mL菌液。发酵时间为7 d，检测CMCase和β-G酶活。蔡晶晶等［22］研究发现，混合菌中的黑曲霉和白腐菌各自所生产纤维素酶系具有互补作用，发酵所得的纤维素酶活高于2种菌单菌发酵酶活，于2种霉菌生长2 d后接入酵母，有利于消除混合发酵体系中水解的还原糖对发酵产酶形成的反馈抑制，同时酵母分泌的少量蛋白类活性物质等可能对白腐菌和黑曲霉的生长、代谢及发酵产酶具有潜在的促进作用，因此，预处理效果检测实验采取多菌发酵方法，实验结果如图1所示。

图1 预处理方式对发酵产CMC酶活及β-G酶活的影响Fig.1 Effects of pretreatment methods on the production of CMCase and β-G

从图1可以看出：稀酸处理的稻草粉原料作为主要固态发酵培养基，发酵产纤维素酶活力都稍低于未处理组，由于经过稀酸预处理之后，稻草粉原料中的纤维素、半纤维素和木质素的组成发生变化，大部分半纤维素被脱除，影响微生物的生长和代谢产酶；同时稀酸处理水解反应会产生一些抑制性物质，如糠醛、羟甲基糠醛以及小分子酸等，这些物质对发酵微生物的活性也会产生影响。在2%稀酸处理后，所产 β-G酶比酶活大幅下降，仅为26 242.85 U/g。从表1中看出，2%稀酸处理后，半纤维素被大量脱除，质量分数只有7.34%，而β-G酶又主要由半纤维素诱导产生，所以高浓度的酸处理对于微生物产β-G酶有着较大影响。蔡晶晶等［22］研究发现，混菌发酵体系中，黑曲霉Aspergillus niger NS83产β-G酶能力相对较强，产CMCase酶较弱，而互补的白腐菌 White-rot fungi NS75产CMCase能力较强，产β-G酶能力较弱，由图1结果可以得出，稻草粉原料的稀酸预处理对于黑曲霉的发酵产酶活性有着更大的影响。

从图1中显示的稀碱及稀碱高温预处理的稻草粉原料固态发酵产酶情况，可以看出碱处理后的稻草粉基质所产纤维素酶酶活降低更为明显，其原因可能是稀碱处理不仅破坏了稻草粉的纤维结构，同时还破坏了稻草粉基质中本有的氨基酸、核酸结构组成，其中的氮以NO3-_N和NH4+_N的形式释放流失，导致微生物发酵过程中能够利用的营养物质减少。同时，预处理原料中残留的碱很难洗净，造成混菌发酵后期体系培养基的pH升高，抑制微生物代谢产纤维素酶。虽然稀碱处理可以溶解稻草粉中的部分木聚糖和木质素，使稻草粉基质变得疏松多孔，更加有利于纤维素酶水解糖化，但总体来说，碱处理并不是一种适合发酵产酶的预处理方式。

从图1观察SPORL法及稀酸SPORL法处理的稻草粉原料发酵产酶情况，可以看出亚硫酸盐预处理比未处理原料发酵产纤维素酶酶活有一定提高，8%亚硫酸盐预处理的稻草粉基质发酵产酶最佳，发酵产CMCase和β-G酶比酶活分别达到25 748.32和52 684.8 U/g。与酸碱预处理结果相比，SPORL法处理的原料产酶效果明显提高，这可能因为中性亚硫酸盐相对于酸碱预处理反应温和，降解基质原料中的营养碳水化合物较少，也不会产生糠醛类和有机酸等抑制微生物生长的小分子物质。比较酸处理的稻草粉基质产酶可以发现，酸浓度越大，对诱导产β-G酶越不利。因此，稀酸SPORL法选择0.5%的酸质量分数，CMCase比酶活达到21 511.22 U/g，与未处理相比，没有降低；β-G酶活达到51 508.41 U/g，比未处理组有一定提升。因此，SPORL法及稀酸SPORL法处理过的稻草粉基质比稀酸、稀碱处理更加适合微生物发酵产酶。

2.3 预处理方式对稻草粉基质酶解糖化效果的影响

分别经过5种不同方法预处理后，稻草粉基质进行酶解产糖，检测结果如图2所示。由图2可以看出，稀碱高温处理后的稻草粉基质酶水解率高，达到91.66%。说明时间较长的高温处理能使紧密的稻草粉纤维束结构变得松散，并一定程度破坏组分之间的氢键，有利于纤维素酶的催化水解；其次是稀碱处理后的酶水解率达到86.79%。2种碱处理后，稻草粉基质的酶水解还原糖含量较高，是由于原料中的木质素经NaOH处理后得到有效脱除，同时，NaOH还能引起纤维原料润胀，纤维底物的持水性增强，从而显著提高稻草粉的酶解效果。

在酒精发酵过程中，大部分酵母菌不能利用纤维素酶解糖化液中生成的木糖，因此，水解液中的戊糖含量较低会更利于发酵产醇。从图2中可以看出，稀酸处理后的稻草粉基质酶解得到的戊聚糖含量明显低于其他方法，水解液中质量浓度仅为2.17 g/L。这是由于酸处理的主要作用是脱除半纤维素，在预处理过程中就水解成木糖，但酸处理对于稻草粉基质的酶水解率提高不大，是因为酸处理对于木质素的脱除效果不明显。SPORL法对木质素具有较好的磺化作用，能够增加木质素亲水性，使木质素部分溶出，同时，未溶出的木质素也有相当程度的磺化，使得酶水解底物具有较好的亲水性，有利于提高基质的酶水解率。从图2中可以看出，与SPORL法相比，稀酸SPORL法酶解糖化效果更好，处理稻草粉基质的酶水解率达到84.99%，水解液中产生的戊聚糖质量浓度为3.47 g/L。同时，此法处理后的基质在混菌发酵产酶阶段没有使纤维素酶活降低。因此，综合考虑发酵产酶和酶水解糖化效果，稀酸SPORL法是更合适的预处理方法。

图2 预处理方法对稻草粉酶解的影响Fig.2 Effects of pretreatment methods on batch enzymatic hydrolysis of straw powder

3 结论

不同预处理方法对稻草基质的组成影响不同。稀酸处理对稻草基质中的半纤维素去除效果较好，含量由20.77%下降到7.34%；稀碱高温处理对木质素脱除效果最好，Klason木质素由12.47%下降到7.58%；SPORL法和稀酸SPORL法预处理反应较为温和，预处理后的回收率和组分中纤维素含量相对较高。稀酸SPORL法处理过的稻草粉生物质在发酵产酶和酶解糖化中均具有较好的效果，发酵所得CMCase酶和 β-G酶活分别达到 21 511.22和51 508.41 U/g，酶水解率达到84.99%。

结合发酵产酶效果和酶解糖化效果分析发现，酸处理原料的酶水解液中戊聚糖含量较少，仅为2.17 g/L，利于酵母发酵产醇，但生成一些糠醛类和有机酸，对发酵产酶代谢具有抑制性作用；碱处理能够降低稻草基质中的木质素含量和提高其酶水解效率，稀碱高温处理的酶水解率就达到91.66%，但使基质中的营养成分溶出过多并影响基质发酵后期的环境pH，导致发酵产酶效果明显降低。

SPORL法预处理反应较为温和，对稻草基质中的纤维素结晶结构和木质素具有破坏和磺化作用，有利于发酵微生物降解和利用纤维素，8%亚硫酸盐预处理稻草基质发酵产CMCase和β-G酶酶活分别达到25 748.32和52 684.8 U/g，比未处理稻草基质发酵产酶效果有一定提高，但在水解糖化效果方面则逊于稀酸SPORL法。综合考虑预处理方法对稻草基质固态发酵产酶和酶水解糖化的效果，稀酸SPORL法兼具同样发酵产酶效果和较高的酶水解率以及较低的戊聚糖得率，是一种更加合适的预处理方法。

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（责任编辑 管 珺）

Production and characterization of cellulase from straw biomass pretreated with different methods

SHEN Jiangtao，DUAN Xuehui，ZHENG Xifan，ZHANG Qian，NIU Shucao
（College of Food Science and Food Engineering，State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Straw powder was pretreated by diluted acid，diluted alkali，high temperature with diluted alkali，sulfite pretreatment（SPORL），sulfite pretreatment with diluted acid（SPORL with diluted acid）. The effects of pretreatment on the cellulases production by solid state fermentation and the yield of fermentable sugars hydrolyzed were studied.Results showed when the straw substrate pretreated by diluted acid with SPORL for cellulase fermentation，carboxymethyl cellulase（CMCase）and β-glucosidase（β-G）activities reached 21 511.22 U/g and 51 508.41 U/g，respectively.The hydrolyze rate of cellulases reached 84.99%.The cellulase activities decreased in different degrees excluding SPORL.The diluted acid method was better to remove hemicelluloses，and the content of hemicelluloses decreased from 20.77%to 7.34%in pretreated straw substrate.The high temperature with dilute alkali had a significant effect on klason lignin removal.The content of klason lignin decreased from 12.47%to 7.58%in straw substrate.Further cellulose enzymolysis experiment showed that the enzymatic hydrolysis conversion rate of untreated straw powder was only 17.82%，while the high temperature with dilute alkali pretreatment was the best method，the hydrolyze rate of pretreated straw powder could reach 91.66%.In the enzymolysisliquid of straw substrate pretreated by dilute acid or SPORL with dilute acid，the content of pentosan was relative low，only 7.38%and 6.92%，respectively.

cellulase；mixed fermentation；pretreatment；SPORL；enzymatic saccharification

TQ353

A

1672-3678（2015）05-0061-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.012

2014-09-04

沈江涛（1990—），男，四川攀枝花人，硕士研究生，研究方向：生物催化与应用；段学辉（联系人），教授，E-mail：xhduan@ncu.edu.cn