张 凯，蔡 恒，汪 晨

（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800）

通过DNA改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc

张 凯，蔡 恒，汪 晨

（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800）

利用DNA改组技术对赖氨酸脱羧酶野生型基因ldc进行随机突变，在大肠杆菌Escherichia coli JM109中构建赖氨酸脱羧酶突变体库。从E.coli JM109和蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009中分别克隆出赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc。查询NCBI数据库得知，二者的同源性为75%。分别构建重组质粒pTrc99a-cadA和pTrc99a-ldc，以此2种质粒为模板，经PCR扩增，获得目的基因片段，分析目的基因片段中存在的限制性酶切位点，用多种限制性内切酶碎片化2种基因，切割成不同大小的片段。这些小片段进行不同组合，突变体经过LBXL平板初筛和高效液相色谱（HPLC）复筛，获得1株酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体，编号为LDC2-16，其比酶活为4 869.86 U/mg（以1 mg总蛋白计），与2种野生型赖氨酸脱羧酶基因表达的酶CadA（1 652.63 U/mg）、Ldc（2 365.93 U/mg）相比，在最适温度37℃、pH 6.0时，突变体的比酶活分别是上述野生型酶的2.95和2.06倍。摇瓶发酵5 h后，目标产物1，5-戊二胺产量从46.9提高至63.9 g/L，提高了36%。

DNA改组；定向进化；赖氨酸脱羧酶；蜂房哈夫尼菌；大肠杆菌

赖氨酸脱羧酶（L-lysine decarboxylase，Ldc，EC 4.1.1.18）是生物体内可逆地催化L-赖氨酸脱羧生成1，5-戊二胺和CO2的高度专一性酶［1］。1，5-戊二胺在农业、医学、化学工业等领域有着广泛的应用。作为一种重要的化工原料，1，5-戊二胺是由可再生原料衍生得到的生物聚酰胺，可以替代传统化工方法生产的生物胺——己二胺［2］，能应用于各种聚酰胺产品、聚氨酯、螯合剂和添加剂等，与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料——新型尼龙［3］。……