赖 颖，赵锦慧，陈 茹

（周口师范学院 生命科学与农学学院，河南 周口 466001）

响应面法优化超声波法提取红枣多糖工艺

赖 颖，赵锦慧，陈 茹

（周口师范学院 生命科学与农学学院，河南 周口 466001）

以新郑红枣为原料，利用响应面法优化超声波提取红枣多糖工艺。以红枣多糖的提取率为参考指标，研究料液比、提取次数、提取时间3个因素对红枣多糖提取率的影响。在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken中心组合试验设计及响应面分析，对料液比、提取次数和提取时间进行优化组合，考察3个因素对红枣多糖提取率的影响。结果表明：提取红枣多糖的最佳工艺条件为液料比16∶1（mL/g）、提取次数2次、提取时间38min，在此最佳条件下，红枣多糖的实际提取率为7.25%；证明此工艺可应用于红枣多糖的大规模提取。

红枣多糖；响应面法；超声波提取；Box-Behnken设计

红枣，又名华枣、刺枣、美枣、良枣，是鼠李科植物枣属的成熟果实，含有丰富的营养，而且味道甜美［1］。红枣的原产地为中国，主要分布于黄河流域，其主要活性成分为生物碱类、黄酮类、维生素类和多糖等。随着新型分离技术以及生命科学技术的发展，对多糖生理活性的研究正受到人们越来越多的重视。有实验表明，红枣多糖具有明显的抗补体活性以及抗肿瘤活性，还有促进淋巴细胞增殖的作用，同时对抗氧化和提高免疫力具有重要作用［2-3］。

目前，用于提取红枣多糖的方法主要有5种，分别是热水提取法、酶提取法、碱液提取法、超声提取法以及微波提取法［4］。采用超声波辅助萃取，利用超声波的空化效应增加溶剂穿透力，提高物质的浸出速度和溶出次数，既能温和地将植物组织分解，又能保持其生物活性不会遭到破坏，同时也会提高红枣多糖的提取率［5］。

本文中笔者以河南新郑红枣为研究材料，进行单因素试验设计［6-8］，分析单因素试验结果，采用Design-Expert软件设计中心组合实验方案优化河南红枣多糖的提取工艺［9-11］，探究利用超声波法提取红枣多糖的工艺流程，以期为红枣多糖的进一步开发利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料

新郑红枣，由周口师范学院实验中心提供。浓H2SO4、苯酚和无水乙醇等试剂皆为市售国产分析纯。

1.1.2 仪器

S22PC型可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；KQ2200型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；1011型电热鼓风干燥箱、FW-100型高速万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司；AL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；HWS12型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红枣多糖的提取工艺

将红枣洗净后去核，于烘箱中烘干，120℃下烘干3 h，烘干结束后，摊晾至凉，用万能粉碎机将红枣粉碎，称取一定质量的红枣粉于锥形瓶中，加一定体积的蒸馏水。置于超声波清洗器中，在设定条件下提取一定时间，然后向其中加入约3倍体积的无水乙醇，使其沉淀，随后用抽滤机抽滤，即可得红枣粗多糖。

1.2.2 红枣多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸比色法测定样品中的多糖含量［12-14］。红枣多糖提取率计算见式（1）。

式中：ρ为提取溶液中粗多糖质量浓度，g/mL；V为提取溶液总体积，mL；m为提取所用的红枣粉质量，g。

1.2.3 单因素试验设计

取红枣粉2.50 g，分成所需份数，以料液比、提取次数、提取时间3个因素进行单因素设计。液料比选取8∶1、12∶1、16∶1和20∶1mL/g，提取次数选取1、2和3次，提取时间选取20、30、40和50min，研究各单因素对红枣多糖提取率的影响。

1.2.4 响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，确定提取次数A、提取时间B、料液比C的范围，每一个自变量的高、中、低实验水平分别为1、0、-1进行编码，根据Box-Behnken中心组合试验原理，以红枣的出糖率为响应值设计三因素三水平的组合进行试验，试验水平与组合见表1。

表1 响应面法设计因素和水平Table 1 The response surface method design factors and levels

2 结果与讨论

2.1 提取时间对红枣多糖提取率的影响

设定提取次数为1次，液料比为12∶1mL/g，考察提取时间（20、30、40和50min）对红枣多糖提取率的影响，结果如图1所示。由图1可知：随着超声提取时间的增加，红枣多糖提取率不断增高，并在超声时间为40min时，红枣多糖提取率最高；但超声时间继续增高时，红枣多糖提取率反而下降。这可能是因为超声时间比较短时，红枣中的多糖浸出不够充分；超声时间过长时，红枣多糖的结构可能被破坏，反而导致红枣多糖的提取率下降，所以红枣多糖的提取时间40min为宜。

图1 提取时间对红枣多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extracting time on extraction yield of polysaccharide from Jujube

2.2 提取次数对红枣多糖提取率的影响

设定提取时间为40min，液料比为12∶1mL/g时，考察提取次数（1、2和3次）对红枣多糖提取率的影响，结果如图2所示。由图2可知：当提取次数为2次时，红枣多糖提取率为6.89%，进一步增加提取次数时，红枣多糖提取率与提取次数为2次时的出糖率相比，增加的幅度不大，从节约能耗、减少工序和生产周期时间以及节约成本的角度来考虑，提取次数2次为宜。

图2 提取次数对红枣多糖提取率的影响Fig.2 Effects of extracting times on extraction yield of polysaccharide from Jujube

2.3 液料比对红枣多糖提取率的影响

设定提取次数为2次，提取时间为40min，考察液料比对红枣多糖提取率的影响，结果如图3所示。由图3可知：材料的液料比不同时，红枣多糖的提取率也明显不同。当液料比从8∶1升到16∶1mL/g时，红枣多糖的提取率由5.45%上升到7.13%；当液料比继续增加时，红枣多糖的提取率反而下降，这说明提取时的液料比与红枣多糖的浸出过程密切相关。这可能是因为溶剂的量增多时，溶剂对超声的能量吸收增多；相对的，红枣对超声的能量吸收减少，细胞壁破坏得不完全而导致多糖提取率下降，所以液料比以16∶1mL/g为宜。

图3 材料的液料比对红枣多糖提取率的影响Fig.3 Effects of material ratio of liquid to solid on extraction yield of polysaccharide from Jujube

2.4 响应面设计结果分析

依据上述单因素试验的结果，以红枣多糖提取率作为参考，以A（提取次数）、B（提取时间）、C（液料比）为自变量，采用多元二次回归的方程拟合试验结果，设计了响应面实验组合来优化河南红枣多糖的提取工艺，响应面设计方案及结果如表2所示。

表2 响应面设计方案及结果Table 2 Results and design of the response surface

采用Design-Expert统计软件对试验结果进行多元回归拟合试验，得到的回归分析结果见表3。由回归方差分析显著性检验表明，由实验数据所得的模型F值为52.77，P值小于0.000 1，说明该模型的回归极显著，并且此模型的R2=0.995 1，表明该模型的自变量与其响应值之间的线性关系显著，与实际的试验拟合度比较高，所以可以用于超声波法提取红枣多糖试验的理论预测。由表3可知，提取次数（A）、液料比（C）、提取次数的平方项（A2）、提取时间的平方项（B2）、液料比的平方项（C2）对红枣多糖的提取率影响极其显著，提取时间（B）对红枣多糖的提取率高度显著，提取次数与液料比的交叉项（AC）影响显著，其他项不显著。由于提取时设定的时间、确定的次数和材料的液料比这3个因素对红枣中多糖出糖率的影响并不是简单的线性关系，采用Design-Expert统计软件对上表进行多元回归分析，明确各因素对响应值Y的影响，得到回归方程：Y=7.23+0.56A+0.28B-0.36C-0.62A2-0.62B2-0.84C2+0.017AB+0.20AC-0.030BC。通过比较回归方程中一次项系数绝对值的大小可以判断影响红枣多糖各因素的主次。本实验中对红枣多糖提取率影响的大小依次为提取次数、材料的液料比、提取时间。

表3 响应面设计试验方差分析及回归系数显著性检验Table 3 The response surface design of variance analysis and regression coefficient significance test

2.5 双因素交互作用的分析

双因素交互作用的分析结果如图4～6所示。由图4可知：当提取次数或提取时间固定时，红枣多糖的提取率随着提取时间或提取次数的增加呈先增大再减少的趋势，二者具有明显的交互作用。由图5可知：随着材料的液料比逐渐增加时，红枣多糖的提取率是先增加再减少的，而且在一定程度上增加提取次数，红枣多糖的提取率会不断增加，但超过一定范围，提取率则变化不大，二者交互作用显著。由图6可知：液料比增加，红枣多糖的提取率是先增加再减少的，而随着提取时间的增加，出糖率是先逐渐增加，而后逐渐趋于平缓甚至有些下降趋势的。

图4 提取次数和提取时间的交互作用对红枣多糖提取率的响应面Fig.4 The response surface and contour of extraction yield of polysaccharide from Jujube on interaction between extracting times and extracting time

图5 提取次数和液料比的交互作用对红枣多糖提取率的响应面Fig.5 The response surface and contour of extraction yield of polysaccharide from Jujube on interaction between extracting times and material ratio of liquid to solid

图6 提取时间和液料比的交互作用对红枣多糖提取率的影响Fig.6 The response surface and contour of extraction yield of polysaccharide from Jujube on interaction between extracting time and material ratio of liquid to solid

为了进一步确认最佳的提取红枣多糖的工艺条件，进一步对回归方程取一阶的偏导数等于零，整理可得式（2）～（4）。

将式（2）～（4）联立成方程组，求得当A=0.482 3、B=0.235 8、C=0.170 3时，提取次数=A+2、提取时间=10B+35、液料比=（10C+14）∶1，从而得到提取次数为2.40次、提取时间为37.40min、液料比为15.70∶1mL/g时，获得的红枣多糖提取率最高，但是为了实际操作的过程中更加便利，红枣多糖的最佳提取工艺条件修正为提取次数2次、时间38min和液料比16∶1mL/g，此条件下红枣多糖的提取率最高。此最优工艺条件下，红枣多糖的提取率理论值为7.32%。而实际条件下所测得的红枣多糖提取率为7.25%，这与理论的预测值7.32%相比，相对误差比较小。因此采用超声波辅助响应面分析法优化萃取红枣中的多糖所获得的工艺条件的参数准确可靠，具有一定的实用价值。

3 结论

通过超声波法提取红枣多糖，根据单因素实验的结果，可知提取次数、提取时间、材料的液料比对红枣多糖的提取率都有显著影响，但不同的单因素对红枣多糖的提取率的影响主次不同，从大到小依次为提取次数、液料比、提取时间。利用响应面法优化了红枣多糖的超声波提取工艺过程，得到影响红枣多糖提取率各因素之间的回归方程：Y=7.23+ 0.56A+0.28B-0.36C-0.62A2-0.62B2-0.84C2+ 0.017AB+0.20AC-0.030BC。通过单因素试验、中心组合试验以及响应面分析，研究了超声波提取红枣多糖的工艺，确定了超声波提取红枣多糖的最佳工艺条件：提取次数2次，提取时间为38min，液料比16∶1mL/g，此最优工艺条件下红枣中多糖的理论提取率为7.32%，实测红枣多糖提取率为7.25%，提取效率比较高，说明超声波法在提取植物多糖方面有着一定的技术优势和广泛的应用前景。

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（责任编辑 管 珺）

Optmiization of ultrasound-assisted extraction technology by response surface methology for extracting polysaccharide of Jujube

LAI Ying，ZHAO Jinhui，CHEN Ru
（College of Life Science and Agriculture，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China）

The purpose was to optimize the extraction of polysaceharides from Jujube.Using extraction yield as criteria，we evaluated the effect of several parameters with the single factor experiment，including solid to liquid ratio，separate times，and extraction time.Then we selected three factors that influenced more significantly on polysaccharide extraction to design Box-Behnken center united experiment by response surface methodology，so to study the interaction of the three factors with the extraction yield of polysaccharide from Jujube.The optimum extraction conditions were as follows：liquid to solid ratio of 16∶1mL/g，separate times for 2 times，extracting time setting for 38min.Under optimal conditions，yield of Jujube polysaceharides was 7.25%.Our study provides the basis for large scale production of Jujube poly saccharides.

Jujube；response surface methodology；ultrasound-assisted extraction；Box-Behnken design

S665.109+.2

A

1672-3678（2015）05-0042-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.008

2014-06-04

赖 颖（1981—），女，辽宁朝阳人，讲师，研究方向：发酵工程、生物能源，E-mail：lydia2050@126.com