黄正刚，陈启文，吴星恒

（南昌大学第一附属医院儿科，南昌330006）

荧光原位杂交技术检测PML／RARa融合基因在儿童APL微小残留病中的应用

黄正刚，陈启文，吴星恒

（南昌大学第一附属医院儿科，南昌330006）

目的应用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）定量检测儿童急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocyticleukemia，APL）PML／RARa融合基因，监测患儿微小残留白血病（minimal residual disease，MRD）。方法对初发、诱导缓解、巩固、维持治疗中的30例APL患儿进行常规形态学检查、流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测及利用FISH进行PML／RARa融合基因定量检测。结果30例初发骨髓细胞形态学及流式细胞术诊断为APL患儿，诱导化疗结束后骨髓细胞形态学均完全缓解，FCM检测MRD阳性19例，阴性11例，但FISH检测PML／RARa融合基因阳性27例，阴性3例。经巩固治疗后细胞形态学完全缓解，FCM检测MRD阴性29例，1例持续阳性最终复发；而FISH检测有7例PML／RARa融合基因检查仍呈阳性，其中3例在第一轮维持治疗后转阴，4例仍呈阳性，经IA方案化疗后，1例转阴，3例持续阳性者最终复发。两种检测方法阳性数比较差异有统计学意义（P＜0.005）。结论FISH检测PML／RARa融合基因较FCM具有更高的敏感度，可以定量检测MRD，为早期预测复发，指导临床治疗提供依据。

荧光原位杂交技术；急性早幼粒细胞白血病，儿童；PML／RARa融合基因；微小残留病灶

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocyticleukemia，APL）是一种特殊类型的白血病，90%以上患者均存在t（15；17）（q22；q21）的染色体易位，并在分子水平上形成PML／RARa融合基因，成为APL特有的分子遗传学标志［1］。目前白血病的生存率虽然已明显提高，但白血病复发仍是影响患者长期无病生存的重要因素，主要原因为在完全缓解患者的体内仍存在微量残留白血病细胞（minimal residual disease，MRD）。PML／RARa融合基因在白血病病程中比较稳定，可用来监测APL微量残留白血病细胞的标志［2］。

本研究通过荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测南昌大学第一附属医院30例儿童APL体内PML／RARa融合基因在化疗过程中表达水平的变化，监测APL患儿体内MRD，并与流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测相比较，分析MRD与患儿治疗反应、预后等方面的相关性，为及时临床用药及预后评估提供实验依据。

1 临床资料

收集本院2008年1月至2013年1月经FISH检测PML／RARa融合基因阳性的APL 30例，男21例，女9例，平均年龄6.6岁，所有患者均按2010版儿童急性早幼粒细胞白血病临床路径化疗。

2 方法

标本采集：分别在诱导治疗第30天、巩固治疗后、每轮维持治疗前各抽取骨髓液行骨髓细胞形态学、融合基因FISH和FCM检查。

2.1 FISH检测PML－RARA融合基因

2.1.1 骨髓标本的收集

将新鲜采集的骨髓1～2 m L置于快速准备好的肝素抗凝管内，并立即颠倒混匀经免肝素凝固，在室温下保存24 h，标本中加入甘油可以长时间保存在－20℃。

2.1.2 标本预处理

1）低渗：用吸管将送检标本转移至15 m L离心管中，1 500 r·min－1离心10 min，去除上清，加入10 m L 4%的氯化钾低渗液，用吸管用力吹打使细胞形成单细胞悬液，放置37℃的水浴箱中低渗20 min。

2）预固定：细胞低渗后，立即加入细胞固定剂0.5 m L，用吸管轻轻吹打混匀，在室温放置2～3 min后，1 500 r·min－1离心10 min。

3）固定：离心后，去除液体，并加入10 m L细胞固定液10 m L，用吸管轻轻吹打混匀后，使细胞形成单细胞悬液，室温放置20 min，1 500 r·min－1离心10 min。离心后去除上清，加入固定液再固定一次，方法同上。

4）滴片：将固定好的标本离心去上清后，用固定液调整到适量密度的细胞悬液，然后取1滴加到泡酸后的玻片上，并使细胞形成单细胞层，并对玻片进行标记。

5）细胞老化：将制备好的滴片标本放置70℃的烤片机或烤箱中老化2 h。

2.1.3 杂交

1）平衡：将老化的玻片标本放置在含2XSSC缓冲液中3 min。

2）梯度脱水：玻片标本平衡后，经70%、85%以及100%的乙醇梯度脱水3 min，脱水后将玻片平放并使其自然干燥。

3）探针杂交液的准备：按每张玻片10∶1杂交液配置，取一EP管，按照下面的配方配置杂交液：杂交缓冲液7∶1，去离子水2.7，探针0.3∶1。探针杂交液经过混匀后待用。

4）变性：将杂交液加到玻片样本中央，盖上盖玻片，并用指甲油封片（用加钙底油），然后放置在78℃的水浴箱中变性5 min。

5）杂交：取出杂交变性后的玻片，立即放置在42℃的湿润的杂交盒中，杂交18～20 h。

2.1.4 洗涤

取出玻片，移去样品玻片上的盖玻片，立即放入68℃的0.4XSSC／0.3%NP－40洗涤液中，震荡1～3 s，洗涤1～5 min后取出，然后放入室温2XSSC／0.1NP－40洗涤液中，震荡1～3 s，洗涤30 s后取出，将玻片放置于70%乙醇中3 min后取出，自然干燥。

2.1.5 封片观察

1）将上述干燥的玻片加上1滴甘油，并盖上盖玻片封片。

2）封片后放置10 min，直接用荧光显微镜观察，初发患者计数200个细胞，治疗后监测MRD计数1 000个细胞，进行结果判断。

2.1.6 结果分析

正常细胞可见2个绿色信号及2个红色的杂交信号；在细胞核中如出现的信号模式为1绿1红2黄色（1G1R2F），或出现额外的红色或绿色或1个单融合的信号模式为异常。

2.2 FCM检测MRD

取肝素抗凝的骨髓，采用Ficoll－Hypaque密度梯度离心法常规分离单个核细胞，以活细胞直接免疫荧光法进行染色，流式细胞仪（美国BD公司）检测5×105～5×106个细胞。将充分洗涤后的标本离心沉淀，除去红细胞，加入荧光单抗（Mc Ab）孵育15 min后上机检测。所用的Mc Ab均为美国BD公司提供的直标抗体，包括PE标记的CD10、CD19、CD13、CD34、CD33及FITC标记的HLA－DR、CD14、CD15、CD41。

阳性判定：以CD13、CD33抗原阳性细胞≥0.1%为阳性，≤0.1%为阴性［3］。

2.3 统计学方法

数据比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

诱导治疗第30 d，30例初发病例经骨髓细胞形态学检查均已达完全缓解，FISH检测PML／RARa融合基因阳性27例；3个巩固治疗结束后，30例患儿骨髓细胞形态学检查均为完全缓解，PML／RARa融合基因阳性7例；7例FISH检测阳性患儿，在第一轮维持治疗后转阴3例，4例连续阳性者，给予IA方案化疗，转阴1例，3例持续阳性最终复发。30例诱导化疗结束骨髓细胞形态学完全缓解患儿；FCM检测MRD阳性19例、阴性11例，经巩固治疗后FCM检测MRD阴性29例，1例持续阳性最终复发。两种检测方法阳性数比较差异有统计学意义（P＜0.005），见表1。

表1 30例APL患儿诱导30 d、巩固化疗后和3轮维持治疗FISH和FCM检测结果比较 例

4 讨论

APL细胞存在染色体易位t（15；17）（q22；q21），形成PML／RARa融合基因，表达PML－RARa融合蛋白，该蛋白是APL发病的重要分子基础［4－5］。PML／RARa融合基因是儿童APL中最常见的融合基因，可作为儿童APL诊断、治疗、评估预后的标志。FISH技术作为一种新的分子遗传学技术，具有操作简单、快速、准确、直观、方便、定量等特点［6］。

MRD是白血病患者经化疗达到临床完全缓解后体内残留不同数量的白血病细胞状态，残留的白血病细胞是白血病复发的根源，因此，定期准确评估患者缓解期间体内残余的白血病细胞数量有利于对患者预后的判断和治疗方案的再选择，是防止白血病复发和提高白血病患者长期生存率的重要措施。MRD目前常用的检测手段包括细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学等。初诊APL患者体内白血病细胞可达（1～4）×1012，经化疗缓解后骨髓细胞形态学白血病细胞≤5%，残留的白血病细胞数仍达106～108，常规细胞形态学就难以检出MRD［7］。常规细胞遗传学分析因分裂相数量和质量的限制，只能检测中期细胞，因此也不是检测MRD的敏感方法。

FISH是应用荧光物质标记特异染色体上的基因作为探针识别染色体数目和结构异常的一种方法，是临床上检测PML／RARa融合基因非常有效的技术之一，也是监测APL治疗效果的敏感方法，在临床上可用来APL的诊断和监测MRD［8］。

白血病相关免疫表型（leukemi－aassociated immunophenotype，LAIP）是由系列交叉抗原表达、抗原表达不同步、过度表达、表达缺乏和（或）异位抗原表达引起，是区别白血病细胞与正常造血细胞的重要特征。有文献报道［9］多数急性白血病患者复发时至少可以检测到1个治疗前的LAIP。因此，临床上FCM同样可以作为多数AML患者残留病变监测的重要方法。目前广泛应用的四色多参数流式细胞术（MP－FCM）检测白血病MRD的敏感度可达10－4，但免疫表型在白血病病程中会发生转换和克隆演变，故可造成假阴性的问题；相对于MP－FCM而言，FISH的灵敏度也可达10－3［10］，且以融合基因作为其检测的靶分子稳定可靠，不存在表型转换和克隆演变而造成假阴性的问题，是目前MRD首选的检测手段。因此，通过FISH技术定期、定量检测APL中的PML／RARa融合基因，可以更灵敏、更精确地反映体内白血病细胞的负荷及其变化趋势，特别是对处于维持治疗期间，用敏感特异的方法定期监测MRD水平，对预后的判断、早期预测复发、治疗方案选择、提高长期存活率等具有重要的临床意义。在本组病例中，诱导化疗第30天骨髓FCM检测11例阴性，但PML／RARa融合基因检测仅3例阴性，差异有统计学意义，说明FISH方法较FCM更加敏感、可靠。

有研究［11］证实MRD水平较其他预后因素能更好地反映患者白血病细胞对化疗药物敏感性等生物学因素的综合效应，可作为临床治疗反应、疾病控制程度、患者是否达到分子学水平缓解的评估指标，较形态学标准、FCM确定缓解更加敏感。本研究通过FISH方法对30例APL患者诱导化疗达完全缓解后进行PML／RARa融合基因定量分析，结果发现30例MRD检测27例阳性，而FCM监测MRD有19例阳性，提示诱导化疗达到完全缓解能消灭患者体内大量白血病细胞，肿瘤负荷明显下降，但绝大部分仍有MRD。在诱导化疗缓解后，常规骨髓形态学检查不能反映患儿体内白血病细胞的负荷及其变化，但FISH及FCM仍可追踪到MRD。因此，对白血病患者需定期、定量监测MRD，密切随访，对MRD持续阳性或MRD水平逐渐升高的患者应及时予强化治疗，以防止复发。本组患者维持治疗期间采用FCM监测MRD 29例为阴性，1例持续阳性，经IA方案化疗后仍阳性最终复发；但FISH检测，发现仍有7例标本MRD阳性，3例经1轮维持治疗后，MRD水平转阴，4例持续阳性者，给予IA方案化疗，1例转阴，3例仍持续阳性最终复发；这可能是因为患者体内白血病细胞的清除是个缓慢的、持续的过程，随着维持治疗的延长，MRD阳性率会逐渐降低，因此MRD阳性率的消长可作为调整化疗方案的一项指标［12］；3例MRD持续阳性而复发，提示这种情况应密切观察，及时调整化疗方案。有研究［13］结果显示PML／RARa融合基因检测2次以上阳性者，100%复发。在本研究中FCM检查在巩固治疗后仅1例持续阳性而复发，但FISH检查仍可检测部分病例MRD阳性，二者最终复发病例数比较差异有统计学意义，说明采用FISH监测MRD敏感性及特异性强于FCM检查。因此，FISH作为PML／RARa融合基因的监测技术，具有良好的敏感性及特异性，是儿童APL诊断及定期监测MRD的可靠方法；定期检测PML／RARa融合基因可以预测病情、及早发现APL在分子水平的复发，及时干预、指导临床治疗。本研究中标本较少，收集更大的样本数进一步研究是非常必要的。

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（责任编辑：钟荣梅）

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1009－8194（2015）11－0065－04

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2015－07－08

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