康文博陈翀李晓红王景景涂悦张赛梁海乾

过表达NeuroD1对脊髓反应性星形胶质细胞转分化为神经元的影响☆

康文博*陈翀*李晓红*王景景*涂悦*张赛*梁海乾*

目的 探讨过表达NeuroD1对脊髓反应性星形胶质细胞转分化为神经元的影响。方法 体外原代培养SD大鼠脊髓星形胶质细胞，以划痕实验制备反应性星形胶质细胞。实验分为空白组（NV组）、对照病毒组（GFP组）和NeuroD1病毒组（NeuroD1组）。各组行划痕处理7 d后，NV组不感染病毒，GFP组感染携带GFP基因的逆转录病毒，NeuroD1组感染同时携带GFP和NeuroD1基因的逆转录病毒，24 h后同时更换神经元条件培养基。各组在1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d观察细胞形态，并采用免疫荧光染色方法分别在感染病毒后7 d观察细胞DCX阳性率和14 d观察细胞NeuN阳性率。结果 更换神经元条件培养基后，各组细胞形态发生改变，胞核明显饱满，胞浆减少，突起减少并延长。与NeuroD1组相比，NV组和GFP组细胞突起短而分枝多，胞核较小。感染病毒后7 d，NV组和GFP组细胞部分形态逐渐恢复以前形态而NeuroD1组维持变化后形态。与NV组和GFP组相比，NeuroD1组出现DCX（9.84%±2.06%）（F=40.107）和NeuN（8.25%±2.78%）阳性细胞（F=21.73），结果差异都有统计学意义（P＜0.05）。结论 在体外培养，NeuroD1的过表达可以介导体外培养脊髓反应性星形胶质细胞转分化为神经元。

NeuroD1转分化 反应性星形胶质细胞 神经元 划痕

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种破坏性极大的中枢神经系统创伤，可造成严重的肢体功能障碍，使患者丧失劳动能力，给家庭和社会造成沉重的负担。SCI后，在细胞水平会出现神经元凋亡缺失、轴突断裂，并且数量最多的星形胶质细胞会迅速活化形成反应性星形胶质细胞（reactive astrocytes，RAS）［1］。RAS过度增生形成的胶质瘢痕不仅对轴突的再生起到了物理阻挡作用［2-3］，还可分泌和释放多种生长抑制因子和炎性因子来抑制轴突再生，严重阻碍神经功能恢复［4-5］。近年来，细胞转分化技术蓬勃发展，这种技术可以直接将某一种成体终末分化细胞特定转化为其他种类的终末分化细胞或某种细胞的前体阶段［6-8］。但是将RAS直接转分化为神经元的研究很少。本研究在细胞阶段，将携带神经分化因子1（Neuronal differentiation 1，NeuroD1）基因的逆转录病毒感染反应性星形胶质细胞，以探讨过表达NeuroD1对导脊髓反应性星形胶质细胞转分化为神经元的影响。

1　材料与方法

1.1研究对象SD孕鼠1只，用于1～3 d新生鼠的原代星形胶质细胞的提取和培养，由解放军军事医学科学院提供。试剂：DMEM/F12（Dulbecco's Modified Eagle Media:Nutrient Mixture F-12）培养基（Gibco，美国）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）（Gibco，美国）、小鼠抗Nestin抗体（Abcam，英国）、兔抗GFAP抗体（Sigma，美国）、小鼠抗NeuN抗体（Abcam，英国）、兔抗DCX抗体（Sigma，美国）、FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗（Life technology，美国）、FITC标记的山羊抗兔IgG二抗（Life technology，美国）、脑源性神经营养因子（Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）（peprotech，以色列）、B-27（Gibco，美国）、固定液（BD，美国）、破膜液（BD，美国）、同型对照抗体（BD，美国）。病毒：对照病毒携带GFP基因，NeuroD1病毒携带GFP和NeuroD1基因，均为逆转录病毒，以MOI值1:100感染细胞，24 h后换液继续培养。由上海和元生物科技有限公司提供。实验分为空白组（NV组）、对照病毒组（GFP组）和NeuroD1病毒组（NeuroD1组）。各组行划痕处理7 d后，NV组不感染病毒，GFP组感染携带GFP基因的逆转录病毒，NeuroD1组感染同时携带GFP和NeuroD1基因的逆转录病毒，24 h后同时更换神经元条件培养基继续培养14 d。

1.2原代星形胶质细胞的提取和鉴定 取1～3 d新生SD大鼠，用75%的酒精浸泡5 min，无菌条件下分离后背皮肤、肌肉与脊椎，暴露脊髓，取出脊髓放入0.01 mmol/L磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）中去除脊髓膜和血管等组织，置于DMEM/F12培养基中用200目不锈钢滤网进行研磨，将滤液转移至15 mL离心管，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入0.25%的胰蛋白酶消化1～2 min，用含有10%FBS的DMEM/F12培养基中止消化，再次离心，弃上清，加入含有10%FBS的DMEM/F12培养基重悬沉淀置于培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养1 h差速粘附，更换培养瓶继续培养至长满80%～90%，置于恒温摇床260 r/ min振荡16 h，换液继续培养并检测纯度［9-10］，以备后用。流式细胞术检测星形胶质细胞纯度：传至第3代后，将星形胶质细胞消化离心收集细胞，加入固定液500 μL悬浮沉淀并进行固定20 min，1400 r/min离心10 min，加入破膜液，取所制样品各100 μL分别加入两个离心管，一只再加入兔抗GFAP抗体5 μL，另一只加入同型对照抗体20 μL，4℃、40 min，上机检测。

1.3划痕损伤制备RAS将星形胶质细胞以1×104种植于48孔板，用10 μL无菌加样枪头沿“井”字划痕，划痕间距0.3 mm，划痕时保持匀速和相同力度。划后换液除去脱落和死亡细胞及碎片，每隔3 d半量换液［11］。免疫荧光（Nestin/GFAP）染色检测RAS：划痕7 d后，4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS浸洗3×5 min，0.5%Triton X-100破膜20 min，PBS浸洗3×5 min，5%BSA封闭孵育20 min，加入一抗（1:1000）兔抗大鼠GFAP标记星形胶质细胞，4℃过夜，PBS浸洗3×5 min，再加入Nestin（1:300）小鼠抗大鼠标记活化的反应性星形胶质细胞，4℃过夜，PBS浸洗3×5 min，后续操作避光，加入二抗（1: 200）羊抗兔抗体绿色，37℃、孵育1 h，PBS浸洗3× 10 min，再加入二抗（1:200）羊抗小鼠抗体红色，37℃、1 h，PBS浸洗3×10 min，加入DAPI染核（1: 100），37℃孵育10 min，PBS浸洗3×10 min，荧光显微镜观察并拍照。

1.4免疫荧光检测转分化效率 分别在感染病毒7 d、14 d行免疫荧光染色。感染病毒后7 d的各组细胞分别加入一抗（1:300）兔抗DCX抗体标记早期神经元，各组用DAPI染细胞核。感染病毒后14 d的各组细胞分别加入一抗（1:200）小鼠抗NeuN抗体标记成熟神经元，各组用DAPI染细胞核。荧光显微镜观察各时间点的转分化效率。

1.5统计学处理 采用SPSS17.0处理实验数据，所得数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较用完全随机设计的方差分析，两两比较采用SNK检验，检测水准α=0.05。

2　结果

2.1原代星形胶质细胞纯度检测 第3次传代后星形胶质细胞纯度检测，见图1。实验分两组，同型对照荧光（图1A）和GFAP荧光（图1B）。数据结果显示纯度为93.94%，符合实验要求，以备后续实验。

图1　流式细胞术检测星形胶质细胞细胞的纯度。图1A显示为同行对照的荧光范围，图1B显示为样品的荧光范围，C图显示为同行对照和样品叠加的范围。

2.2免疫荧光检测RAS倒置荧光显微镜下观察，见图2，各组取6个视野记录Nestin阳性细胞数和GFAP阳性细胞数。RAS可以特异性表达Nestin［12］，同时可以表达GFAP，因此Nestin阳性率可以表示RAS的纯度。Nestin阳性率=（Nestin阳性细胞数/ GFAP阳性细胞数）×100%，各视野Nestin阳性率均大于90%，符合试验要求，以备后续实验。

图2　荧光显微镜（200×）下观察，红色荧光为Nestin，标记RAS，绿色荧光为GFAP阳性细胞，标记星形胶质细胞，蓝色荧光为DAPI阳性细胞，标记细胞核。标尺刻度为100µm

2.3显微镜观察细胞形态改变 光学显微镜下分别在感染后1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d观察各组的细胞形态和划痕处细胞的改变，见图3。感染后7 d内，各组细胞形态发生改变，胞核明显饱满，胞浆减少，突起减少并延长。与NeuroD1组相比，NV组和GFP组细胞突起短而分枝多，胞核较小。病毒感染后7 d，NV组和GFP组细胞形态逐渐恢复以前形态而NeuroD1组维持变化后形态。

2.4免疫荧光染色结果 分别在感染病毒后7 d观察DCX阳性率（图4）和14 d观察NeuN阳性率（图5）。倒置荧光显微镜下观察，各组取6个视野记录DCX或NeuN阳性细胞数和GFP阳性细胞数。DCX或NeuN阳性率=（DCX或NeuN阳性细胞数/ GFP阳性细胞数）×100%。NV组和GFP组的阳性率近乎为0，NeuroD1组的DCX阳性率为9.84%± 2.06%（F=40.107），NeuN阳性率为8.25%±2.78%（F=21.73），都具有统计学意义（P＜0.01）。

3　讨论

图3　光学显微镜（100×）下观察不同时间细胞改变，A组为NV组，B组GFP组，C组NeuroD1组，分别在3 d、7 d和14 d时细胞形态的变化

图4　荧光显微镜（200×）下观察，绿色荧光为GFP阳性细胞，为感染病毒后细胞的自发荧光，红色荧光为DCX阳性细胞，标记早期神经元，蓝色荧光为DAPI阳性细胞，标记细胞核。A组为NV组，B组为GFP组，对照组为NeuroD1组。标尺刻度为100µm

图5　荧光显微镜（200×）下观察，绿色荧光为GFP阳性细胞，为感染病毒后细胞的自发荧光，红色荧光为NeuN阳性细胞，标记成熟神经元，蓝色荧光为DAPI阳性细胞，标记细胞核。A组为NV组，B组为GFP组，对照组为NeuroD1组。标尺刻度为100µm

在脊髓中枢神经系统中，星形胶质细胞的数量约为神经元的4～5倍。SCI后，神经元的缺失同时伴随星形胶质细胞迅速活化为RAS，后者会过度增生形成瘢痕微环境抑制轴突再生和神经功能的恢复。目前，SCI尚缺乏有效的治疗措施，神经元较差的再生能力和抑制性胶质微环境的形成已被公认为是SCI后轴突再生和功能恢复障碍的关键性因素。目前最流行的是细胞替代治疗技术，已从胚胎干细胞发展到多能诱导干细胞重编程技术［13］，现在已进入了转分化技术的时代。转分化技术可以直接将RAS转分化为神经元［14-15］。这样一方面解决了胶质瘢痕问题，解除了对神经轴突再生的抑制；另一方面解决了神经发生的问题，如诱导的神经元与损伤处微环境整合，发挥神经传导的功能，这将对SCI神经功能的修复有着重要的意义。近年来，RAS转分化为神经元的相关研究不断深入，转分化诱导条件不断成熟且诱导方式逐渐多样性，这为神经损伤和神经系统退行性病变的患者带来了曙光。

本研究将携带NeuroD1基因的逆转录病毒感染RAS，以探讨NeuroD1的过表达能否介导脊髓反应性星形胶质细胞转分化为神经元。实验结果表明：①感染后7 d内，各组细胞形态发生改变，胞核明显饱满，胞浆减少，突起减少并延长。各组细胞都发生类似的改变可能是由于细胞为了适应环境改变而发生的形态变化。②与NeuroD1组相比，NV组和GFP组细胞突起短而分枝多，胞核较小。说明NeuroD1组病毒的NeuroD1基因整合到了RAS基因组并开始了转录和翻译，形态开始向神经元改变。而NV组和GFP组细胞发生改变只是适应性的改变。病毒感染后7 d，NV组和GFP组大部分细胞形态逐渐恢复以前形态而NeuroD1组大多维持变化后形态。更能说明NeuroD1基因发挥了明显的作用。③NV组和GFP组的DCX、NeuN阳性率均近乎为0，NeuroD1组的DCX阳性率为（9.84%±2.06%），NeuN阳性率为（8.25%± 2.78%），都具有统计学意义（P＜0.01）。说明在病毒感染后7 d，NeuroD1的过表达介导脊髓反应性星形胶质细胞转分化为早期神经元；而感染后14 d，转分化为成熟神经元。

综上所述，将携带NeuroD1基因的逆转录病毒感染反应性星形胶质细胞后，NeuroD1的过表达可以介导脊髓反应性星形胶质细胞转分化为神经元。本研究所进行的体外实验为后期的体内实验提供了可靠的理论依据。但是还存在一些不足：①转分化的效率很低；②转分化而来的神经元是否可以有电活动未经证明。以上问题有待后续的实验进一步研究。

［1］Sofroniew MV.Molecular dissection of reactive astrogliosis and glialscarformation［J］.TrendsNeurosci，2009，32（12）: 638-647.

［2］Min KJ，Jeong HK，Kim B，et al.Spatial and temporal correlation in progressive degeneration of neurons and astrocytes in contusion-inducedspinalcordinjury［J］.JNeuroinflammation，2012，9（5）:100.

［3］Wanner IB，Anderson MA，Song B，et al.Glial scar borders are formed by newly proliferated，elongated astrocytes that interact to corral inflammatory and fibrotic cells via STAT3-dependent mechanisms after spinal cord injury［J］.J Neurosci，2013，33（31）:12870-12886.

［4］Yuan YM，He C.The glial scar in spinal cord injury and repair［J］.Neurosci Bull，2013，29（4）:421-435.

［5］Cregg JM，DePaul MA，Filous AR，et al.Functional regeneration beyond the glial scar［J］.Exp Neurol，2014，253（3）: 197-207.

［6］Amamoto R，Arlotta P.Reshaping the brain:Direct lineage conversion in the nervous system［J］.F1000Prime Rep，2013，5:33.

［7］Vierbuchen T，Ostermeier A，Pang ZP，et al.Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors［J］.Nature. 2010，463（7284）:1035-1041

［8］Szabo E，Rampalli S，Risueno RM，et al.Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors［J］.Nature，2010，468（7323）:521-526.

［9］Wu BY，Liu RY，So KL，et al.Multi-lipofection efficiently transfected genes into astrocytes in primary culture［J］.J Neurosci Methods，2000，102（2）:133-41.

［10］林奕辉，武衡.大鼠嗅靶细胞和星形胶质细胞对神经干细胞分化作用的比较研究［J］.中国神经精神疾病杂志，2007，33（10）：609-612.

［11］Yang H，Qian XH，Cong R，et al.Evidence for heterogeneity of astrocyte de-differentiation in vitro:astrocytes transform into intermediateprecursorcellsfollowinginductionofACM from scratch-insulted astrocytes［J］.Cell Mol Neurobiol，2010，30（3）:483-491.

［12］Luna G，Lewis GP，Banna CD，et al.Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Müller cells following retinal injury:a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin［J］.Mol Vis，2010，16:2511-2523.

［13］Dolmetsch R，Geschwind DH.The human brain in a dish:The promise of ipsc-derived neurons［J］.Cell，2011，145:831-834.

［14］Heinrich C，Blum R，Gascón S，et al.Directing Astroglia from the Cerebral Cortex into Subtype Specific Functional Neurons［J］.PLoS Biol，2010，8（5）:e1000373.

［15］Guo Z，Zhang L，Wu Z，et al.In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer’s disease model［J］.Cell Stem Cell，2014，14（2）: 188-202.

The influence of overexpression of NeuroD1 on transdifferentiation of spinal cord reactive astrocytes intoneurons.

KANG Wenbo，CHEN Chong，LI Xiaohong，WANG Jingjing，TU Yue，ZHANG Sai，LIANG Haiqian.Institute of Traumatic Brain Injury and Neurology，Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces，Tianjin Key Labrotary of Neurotrauma Repair，Tianjin 300162，China.Tell：022-60577125.

Objective To investigate the effect of the overexpression of NeuroD1 on mediating transdifferentiation of spinal reactive astrocytes into neurons.Methods Spinal cord astrocytes were cultured from the SD rat，and reactive astrocytes were prepared by scratches treatment.Cells were divided into blank groups（NV group），control virus group（GFP group）and NeuroD1 virus group（NeuroD1 group）.At 7 d after scratches treatment，GFP and NeuroD1 groups were infected with retroviruses carrying the GFP gene and and GFP gene plus NeuroD1 gene，respectively，whereas NV group was not infected with the virus.Twenty-four hours late，the culture medium were replaced by neuron conditioned medium.Cell morphology was examined at 1，2，3，5，7 and 14 d.DCX positive and NeuN positive cells were detected at 7 d and 14 d after infection by using immunofluorescence staining method，respectively.Results After replacement with the neuron conditioned medium，the nucleus was obviously plump，the cytoplasm was thin and neurites was reduced and extended.Compared with the NeuroD1 group，neurites of NV group and GFP group were shorter with many branches andthe nucleus was smaller.At 7 d after infection，cell morphology of NV group and GFP group gradually recovered，but cell morphology of NeuroD1 group did not.Compared with NV group and GFP group，NeuroD1 group had more DCX（9.84± 2.06%）and NeuN（8.25±2.78%）positive cells［F values 40.107 for DCX and 21.73 for NeuN（P＜0.05）］.Conclusion The overexpression of NeuroD1 can mediate the transdifferentiation of spinal reactive astrocytes into neurons.

NeuroD1 Transdifferentiation Reactive Astrocytes Neurons Scratches

R651

A

2015-03-27）

（责任编辑:甘章平）

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.09.010

☆国家自然科学基金项目（编号：81301050，81271392，81401067）；天津市应用基础与前沿技术研究计划（编号：14JCQNJC10200，15JCYBJC28100）；中国博士后基金项目（编号：2013M542583）

*武警后勤学院附属医院脑科医院，脑创伤与神经疾病研究所，天津市神经创伤修复重点实验室（天津 300162）