吴清林，邹水洋，陈雁

（东莞理工学院化学与环境工程学院，广东东莞523808）

米根霉直接发酵玉米粉生产L-（+）-乳酸的研究

吴清林，邹水洋，陈雁

（东莞理工学院化学与环境工程学院，广东东莞523808）

以米根霉（Rhizopus oryzae）NRRL395为生产菌，玉米粉为发酵基质，对玉米粉与水两相分开灭菌冷却后混合制成玉米粉悬浊液发酵生产L-（+）-乳酸的新工艺进行了研究。试验结果表明，新工艺在不添加任何外源营养的情况下，以150 g/L天然玉米粉为培养基可产L-（+）-乳酸88.8 g/L，L-（+）-乳酸对玉米粉的转化率达到59.2%，对葡萄糖的转化率达到72.4%。该工艺克服了玉米粉在浓度较高情况下由于蒸煮灭菌冷却后呈凝胶而不能被发酵的困难；且省去酶解糖化操作，使成本降低，具有较高的应用价值。

米根霉；玉米粉；L-（+）-乳酸；新工艺

L-（+）-乳酸是一种重要的化学品，在食品、医药及化工领域有着广泛的用途［1］。L-（+）-乳酸的生产可由化学合成法和发酵法2种方法实现。然而该产品如果应用于食品或医药领域则发酵法生产的L-（+）-乳酸较为安全可靠。发酵法生产L-（+）-乳酸的菌种主要有细菌和真菌2类微生物，其中真菌自身能够产生淀粉酶和糖化酶，可直接利用淀粉质原料进行发酵；发酵生产的L-（+）-乳酸纯净度较高，而高光学纯度的L-（+）-乳酸是生产可生物降解高分子材料——聚乳酸所必需的［2］。因而利用根霉发酵生产L-（+）-乳酸在科研和生产上被广泛采用。

聚乳酸能否在市场上取代聚乙烯等塑料产品取决于聚乳酸的原料——L-（+）-乳酸的生产成本能否有效降低。近年来人们在以米根霉为菌种发酵初级农产品生产L-（+）-乳酸研究中，围绕菌种改良、发酵工艺条件优化以及反应器的选择进行了大量的探索，然而在发酵工艺上始终没有实现有效的突破。以农产品粗粉或淀粉为基质的发酵在蒸煮灭菌过程中会导致糊化，浓度高时冷却后会变成凝胶状，需要液化后才可以进行发酵。Hang等早在1989年就发文报道了米根霉可直接发酵玉米粉生产L-（+）-乳酸的成果［3］，然而，在玉米粉浓度较低时，蒸煮灭菌冷却后的基质仍处于流质状态，尚可被米根霉发酵（这种基质与水混合后蒸煮灭菌冷却后发酵的工艺方法我们称之为传统工艺），但当玉米粉浓度较高时，蒸煮灭菌冷却后的基质呈凝胶状态，米根霉则无法将其发酵。然而低浓度基质的发酵导致L-（+）-乳酸产量低下，这是对能源、设备等资源的极大浪费，不利于降低生产成本。白冬梅等利用玉米生粉不经蒸煮灭菌直接进行了米根霉L-（+）-乳酸发酵的尝试［4］，但杂菌污染成了影响发酵的主要问题。

为了实现在较高基质浓度条件下的发酵，我们设计了2个思路：其一是采用生料发酵，用抗生素抑制杂菌生长（试验取得了良好的效果，将另文报道）；其二是将发酵基质与水分开灭菌，冷却后混合，使基质在液相中呈悬浊液状进行发酵（我们把这种固液两相分开灭菌的方法称之为新工艺）。新工艺能在较高基质浓度下发酵，且省去了添加外源淀粉酶、糖化酶的酶解糖化操作，对于降低L-（+）-乳酸的生产成本具有重要意义，有较高的应用价值。

1材料与方法

1.1菌种

米根霉（Rhizopus oryzae）NRRL395。

1.2培养基

1.2.1固体种子培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。

1.2.2发酵培养基

碳源+氮源+无机盐。

碳源：玉米粉（市售，烘干至恒重后备用）；

氮源（g/L）：2；

无机盐（g/L）：KH2PO40.2，MgSO40.1，ZnSO4·7H2O 0.05，CaCO3100。

1.3培养方法

1.3.1种子培养

将米根霉接种到盛有PDA培养基的200 mL三角瓶中，于28℃下培养5 d～7 d长满黑色孢子后冷藏。

1.3.2孢子悬液的制备

将长满黑色孢子的米根霉菌种加入100 mL的无菌生理盐水稀释，制成约含有108/mL个米根霉孢子的孢子悬浮液。

1.3.3发酵培养方法

500 mL三角瓶，加液量100 mL，每瓶接种量5× 106个孢子，在180 r/min、33℃条件下摇床培养64 h。接种后即加入10 g灭菌CaCO3/瓶。

1.3.4传统工艺

准确称量一定量的玉米粉，加入100 mL水混匀于115℃灭菌30 min，然后按上述1.3.3中的发酵培养方法培养。

1.3.5新工艺

准确称量一定量的玉米粉盛入500 mL三角瓶中，同时准确量取100 mL水于200 mL三角瓶中，分别在115℃灭菌30 min，冷却后将二者混合制成悬浊液，再按上述1.3.3中的发酵培养方法培养。

1.3.6玉米粉双酶糖分步发酵培养

准确称取15.0 g玉米粉盛入500 mL三角瓶中，加入100 mL水混匀，然后加入0.05 g α-淀粉酶混合均匀后，于恒温水浴锅70℃保温1 h，再加入糖化酶在30℃条件下糖化24 h，制成玉米粉双酶糖，于115℃灭菌30 min，再按上述1.3.3中的发酵培养方法培养。

1.3.7玉米粉发酵培养

培养方法与1.3.5新工艺相同，但不添加氮源及除CaCO3外的无机盐。

1.4分析方法

1.4.1L-（+）-乳酸钙的测定

EDTA定钙法。

1.4.2残糖的测定

3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法。

1.4.3玉米粉水解物总糖含量的测定

采用酸解法将玉米粉中淀粉水解完全后用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖含量，测得1.000 g干燥的玉米粉水解物总糖含量为0.818 27 g，以下乳酸对葡萄糖转化率的计算以此为基准。

2结果与讨论

2.1不同基质浓度条件下新工艺与传统工艺的比较

对不同玉米粉浓度条件下新工艺与传统工艺的发酵情况进行了考察。由试验结果（表1、表2）可以看出：传统工艺条件下，在玉米粉浓度超过150 g/L时，由于糊化玉米粉冷却后变成凝胶状固化，通气性、传质性丧失，米根霉不能将其发酵。基质浓度在120 g/L及以下时，糊化玉米粉还能呈流动状态，有一定的通气性，可以被米根霉发酵。但过低的基质浓度势必造成效率低下，资源浪费，不利于总体生产成本的控制。在新工艺条件下，解决了传统工艺中基质浓度较高不能被发酵的问题，但也并不是玉米粉的浓度越高越好，当浓度达到180 g/L时，L-（+）-乳酸产量虽有所提高，但转化率降低了。所以新工艺条件下150 g/L的玉米粉是最适宜的基质浓度。

表1　不同浓度的玉米粉对米根霉L-（+）-乳酸发酵的影响（传统工艺）Table 1Different concentrations of corn flour for the influence of Rhizopus oryzae fermentation to L-（+）-lactic acid（traditional technology）

表2　不同浓度的玉米粉对米根霉L-（+）-乳酸发酵的影响（新工艺）Table 2Different concentrations of corn flour for the influence of Rhizopus oryzae fermentation to L-（+）-lactic acid（new technology）

另外我们发现在新工艺的培养条件下米根霉菌丝体呈现分散的小球状，类似煮熟绽开的米粒，而在葡萄糖基质中培养时菌丝体呈现一大块扁平絮状物。有研究表明，米根霉的球状菌丝体比团块状、絮状更适宜发酵产酸［5-6］。本试验中米根霉菌丝球的形成可能是玉米颗粒表面的蜡质和角质可以起到固定化载体的作用，使菌丝体分散，这有利于传质而促进发酵。

2.2玉米粉新工艺发酵与玉米粉双酶糖分步发酵的比较

新工艺属于直接发酵，也被称为同步糖化发酵，而玉米粉双酶糖是玉米粉经淀粉酶和糖化酶液化及糖化处理后获得，所以玉米粉双酶糖发酵属于分步糖化发酵。我们比较了2种工艺的发酵情况，结果见表3。

表3　玉米粉新工艺发酵与玉米粉双酶糖分步发酵的比较Table 3New technology of corn flour fermentation compared with the step fermentation of double enzyme sugar hydrolyzed from corn flour

由表3可以看出，玉米粉双酶糖发酵的L-（+）-乳酸产量和转化率高于新工艺，但由于双酶糖的制备耗时耗能并使工艺步骤复杂化以及消费昂贵的酶制剂（淀粉酶液化需70℃保温1 h，糖化酶糖化需30℃保温24 h），工业生产条件下不利于生产成本的降低。新工艺L-（+）-乳酸发酵，在玉米粉浓度150 g/L时，产量接近90 g/L，对葡萄糖的转化率达到了73.2%，对玉米干粉的转化率达到了59.9%，也就是新工艺条件下发酵1 t玉米粉可以得到近600 kg的L-（+）-乳酸。

2.3新工艺条件下玉米粉中添加无机盐及氮源与否的比较

玉米粉、大米粉等淀粉质农产品是米根霉的天然培养基，其除了主要含有淀粉外还含有蛋白质、脂肪以及均衡的维生素和矿物质等营养，在不添加无机盐及氮素营养的情况下同样能满足米根霉生活的需要，因此我们在玉米粉中不添加氮源和无机盐来考察米根霉的发酵情况，结果见表4。

表4　新工艺条件下玉米粉中添加无机盐及氮素营养与否的比较Table 4The contrast of cornmeal adding inorganic salts and nitrogen nutrition or not in the new process

由表4可以看出玉米粉在不添加任何外源营养物的情况下，发酵效果跟对照相比几乎没有差别。说明利用玉米粉为基质，采用米根霉为菌种发酵生产L-（+）-乳酸，可以无需添加无机盐以及氮源等因素。这样就使发酵工艺进一步简化，成本进一步降低。

3结论

以米根霉为菌种，以不添加任何外源营养物的天然玉米粉为培养基，以固液两相分开灭菌然后制成玉米粉悬浮液的新工艺进行发酵生产L-（+）-乳酸，克服了传统工艺固液两相混合后灭菌基质糊化，在较高浓度下呈凝胶状态而不能被发酵的困难。新工艺在不添加任何外源营养的情况下，以150 g/L天然玉米粉为培养基可产L-（+）-乳酸88.8 g/L，L-（+）-乳酸对对玉米粉的转化率达到59.2%，对葡萄糖的转化率达到72.4%。该工艺还可以省去酶解糖化操作，使工艺简化、成本降低，具有较高的工业应用价值。依据新工艺的思想若能设计出相应的新型反应器，将为新工艺的工业化应用提供支持。

［1］Martinez F A C，Balciunas E M，Salgado J M，et al.Lactic acid properties，applications and production:a review［J］.Trends in Food Science＆Technology，2013，30（1）:70-83

［2］Ohara H.Poly-L-Lactic acid as biodegradable plastic［J］.Biosci Indust，1994，52（2）:642-644

［3］Hang Y D.Direct fermentation of corn to L-（+）-lactic acid by Rhizopus oryzae［J］.Biotechnol Lett，1989，11（4）:299-300

［4］白冬梅.玉米生粉发酵生产L-乳酸的研究［J］.化学工程，2002，30（3）:50-54

［5］Liao W，Liu Y，Frear C，et al．A new approach of pellet formation of a filamentousfungus-Rhizopusoryzae［J］．BioresourceTechnology，2007，98（18）:3415-3423

［6］章华婷，黄莹，付永前.米根霉菌球特性对乳酸发酵的影响［J］.微生物学报，2015，55（3）:372-378

The Study on the Direct Fermentation of Corn to L-（+）-lactic Acid by Rhizopus oryzae

WU Qing-lin，ZOU Shui-yang，CHEN Yan
（College of Chemistry and Environment Engineering，Dongguan University of Technology，Dongguan 523808，Guangdong，China）

In the traditional fermentation process of L-（+）-lactic acid production，high amount of corn flour used to be autoclaved with certain amount water together to make growth medium.After cooling down，this medium formed sticky gel，which was hard for further fermentation process.In this study，corn flour was sterilized first，then suspended thoroughly in sterilized water to make the growth medium.With this medium，Rhizopus oryzae NRRL395 was used to produce lactic acid.The results showed that without adding any extra nutrition，88.8 g/L of L-（+）-lactic acid was produced with 150 g/L of corn flour growth medium.The convert rate of corn flour reached 59.2%，and convert rate of glucose reached 72.4%.In this fermentation process，no enzymatic saccharification process was need，reducing the total cost.Therefore，this new fermentation process showed high potential for the production of L-（+）-lactic acid.

Rhizopus oryzae；corn flour；L-（+）-lactic acid；new technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.017

2015-05-19

东莞市科技计划项目（19）

吴清林（1963—），男（汉），讲师，博士，研究方向：生物化学工程。