王端，周鸿翔，王晓丹，邱树毅，田娅玲

（贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025）

响应面法优化酶解核桃多肽提取工艺

王端，周鸿翔*，王晓丹，邱树毅，田娅玲

（贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025）

以脱脂粉为原料，利用酶解法提取制备核桃多肽。在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，运用Design Expert8.0.6数据统计分析软件，采用四因素三水平的响应面分析法，以多肽得率为响应值，研究了底物质量浓度、温度、时间、pH对核桃多肽得率的影响，并优化了提取工艺。确定了酶解法提取核桃多肽的最佳工艺条件为：底物质量浓度2.3%，温度51℃，时间5.2 h，pH6.5，在此条件下多肽得率为0.45 g/g。

核桃多肽；酶解法；响应面分析法；提取工艺

核桃（Juglans regia L.）又名胡桃，是胡桃科核桃属植物。其果肉营养丰富，除含有大量的蛋白质外，还含有不饱和脂肪酸及维生素、矿物质等，被医学家和养生学家视为益寿精品［1］。近年来科学研究发现，蛋白质经人体摄取消化后，并非主要以氨基酸形式吸收，而是以肽的形式吸收［2］。这些肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，还具有易于吸收，通过消化道进入人体后无任何副作用等优点。从生理功能来说，多肽优于氨基酸和蛋白质，是部分取代氨基酸和蛋白质等营养物质的食品［3-4］，具有调节人体机能等多种生理功能，近年来备受各国科学家和政府的高度重视。因此，本实验利用中性蛋白酶水解脱脂粉制备多肽，确定最佳水解条件，以期为核桃蛋白的深加工及大规模生产提供新的思路。

1材料与方法

1.1材料与试剂

核桃：市售一级品；脱脂核桃粕：实验室自制；谷胱甘肽标准品：贵州迪大生物科技有限责任公司；中性蛋白酶、胰蛋白酶：江苏锐阳生物科技有限公司，碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶：上海蓝季科技发展有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

50T小型香油液压压榨机：德州市恒翔机械制造厂；FW-100高速万能粉碎机、DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅、101-1AB型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；723N可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；7DL-40B台式离心机：上海安亭科学仪器厂制造；索氏抽提仪：北京赛福莱科技有限公司；电子天平：FA2004N上海菁海仪器设备有限公司；ATN-300全自动凯氏定氮仪：上海洪纪仪器设备有限公司。

1.3试验方法

1.3.1核桃肽的制备工艺流程

核桃→去壳→核桃仁→碱液去皮→水洗→低温烘干核桃仁→粉碎→液压榨油→核桃粕→粉碎→正己烷去残油、烘干→脱脂粉→酶解制备多肽→测定多肽得率

1.3.2酶活的测定

蛋白酶酶活的测定：福林法GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》。

1.3.3脱脂粉中基本成分的测定

粗蛋白的测定：凯氏定氮法GB5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；粗脂肪的测定：索氏抽提法GB/T 5009.6-2003《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》；水分的测定：直接干燥法GB5009.3-2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》。

1.3.4多肽的测定

采用双缩脲法［5-6］。

1.3.5响应面分析法优化核桃蛋白提取工艺

根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，综合单因素实验结果，选取底物质量浓度（A）、温度（B）、酶解时间（C）、pH（D）4个因素为自变量，以多肽得率（R）为目标函数，采用四因素三水平的响应面分析法进行实验设计，其因素水平编码表如表1所示。

表1　因素水平编码表Table 1Coding of factors and levels

1.3.6多肽得率的计算

多肽得率/（g/g）=酶解液中多肽的质量/脱脂粉的质量

2结果与分析

2.1最适蛋白酶的选择

经正己烷制得的脱脂粉中粗蛋白含量65.38%；粗脂肪含量0.57%；水分含量11.74%。根据核桃蛋白的氨基酸组成以及酶的性质差异，筛选出几种常见的蛋白酶并在其最适条件下对核桃蛋白进行酶解，酶解效果见图1。

图1　蛋白酶种类对核桃蛋白酶解效果的影响Fig.1Effect of protease type on the leaching rate of walnut polypeptide

由图1可知，中性蛋白酶对核桃多肽的酶解效果最好（得率0.186 g/g），其次是碱性蛋白酶（得率0.151 g/g），胰蛋白酶的效果最差（得率0.116 g/g）。综合考虑，选择中性蛋白酶为酶解制备多肽的最佳酶。

2.2响应面分析法优化核桃多肽的提取工艺

根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，按表1的因素水平编码表，以多肽得率（R）为响应值，采用四因素三水平的响应面分析方法进行实验设计，其实验设计及结果如表2所示。采用Design Expert8.0.6统计软件对实验结果进行响应面回归分析，回归方程的方差显著性检验分析结果如表3所示。

表2　响应面试验设计及结果Table 2Response surface experimental design and results

续表2响应面试验设计及结果Continue table 2Response surface experimental design and results

表3　回归分析结果Table 3The results of regression analysis

由表3可知，一次项中，各因素对多肽得率的影响由大到小依次为底物质量浓度＞时间＞pH＞温度，其中底物质量浓度和时间的影响极显著（P＜0.01），pH的影响显著，而温度的影响则不显著；二次项中A、B、C、D对多肽得率的影响都达到极显著水平（P＜0.01）；交互项中，只有AB对多肽得率有极显著的影响（P＜0.01），而AC、AD、BC、BD、CD之间的交互作用不显著。

以A、B、C、D为自变量，多肽得率R（g/g）为响应值，建立二次响应面回归模型，经Design-Expert8.0.6软件对表2实验数据进行多元回归拟合后，得回归方程：R=0.41+0.045A+8.833×10-3B+0.015C-0.011D+ 0.036AB-9.750×10-3AC+1.750×10-3AD+2.250×10-3BC+ 0.012BD+9.250×10-3CD-0.075A2-0.049B2-0.027C2-0.048D2

从表3可知，以多肽得率为响应值时，模型P＜0.000 1，表明模型的回归极显著。同时失拟项P= 0.416 5＞0.05，表明响应面试验结果和数学模型拟合良好，试验误差小，因此，可以使用该数学模型对试验结果进行分析。为了考察因素间的交互效应关系对核桃多肽得率的影响，选取两个因素固定于零水平，绘制响应曲面图，结果如图2所示。

图2　各因素交互效应对多肽得率的响应曲面图Fig.2Response surface map of cross effects of each factor

从图中均可直观地反映出各因素间的交互效应以及对多肽得率的影响。总体来看，随着交互因素编码值的增大，多肽得率呈现先上升后减小的趋势。其中，底物质量浓度和温度的交互作用对多肽得率的影响较明显，呈显著的先增大后减小趋势，而其他因素间的两两交互作用均是先增大，后增大不明显，最后减小或先增大后趋于不变。因此，只有当底物质量浓度、温度、时间、pH 4个因素间合理组合时才能获得较好的酶解效果。

2.5试验条件的优化与确定

采用Design-Expert 8.0.6软件优化的提取工艺条件为底物质量浓度2.3%，温度51℃，时间5.2 h，pH 6.5，多肽得率的预测值0.42 g/g。在此工艺条件下进行3次重复验证试验，实际测得多肽得率0.45 g/g，比预测值提高了7.14%，表明响应面设计在核桃多肽提取工艺中可行，结果可靠。

3结论

在单因素试验的基础上采用四因素三水平的响应面分析法对提取核桃多肽进行优化。结果表明，最佳工艺条件为：底物质量浓度2.3%，温度51℃，时间5.2 h，pH6.5，在此条件下多肽得率为0.45 g/g。因此，响应面分析法为优化核桃多肽的提取工艺提供理论依据。

［1］吕名蕊，史宣明，张骊，等.核桃多肽功能特性及制备工艺研究进展［J］.中国油脂，2013，38（5）:34-38

［2］SZETAO K W C，SATHE S K.Walnut（Juglans Regial）：Proximate Composition，Protein Solubility，Protein Ammo Acid Composition and Protein in Vitro Digestibility［J］.J Sci Food Agric，2000，80: 1393-1401

［3］姜莉，徐怀德，陈金海，等.核桃多肽果味酸奶的研制［J］.中国乳品工业，2012，40（12）:54-57

［4］张兴灿.核桃蛋白多肽新型酶解制备工艺的研究［D］.昆明:昆明理工大学硕士学位论文，2012

［5］刘亚斌，陈树俊，张海英，等.核桃肽乳营养饮料的研制［J］.农产品加工，2011（3）:56-61

［6］徐娟，吕嘉枥.乳蛋白水解液中多肽含量测定方法的研究［J］.食品科技，2010，35（12）:275-277

Optimization of Extracting Polypeptide from Walnut by Response Surface Methodology

WANG Duan，ZHOU Hong-xiang*，WANG Xiao-dan，QIU Shu-yi，TIAN Ya-ling
（Guizhou Key Lab of Fermenting Engineering and Bio-pharmacy，Wine and Food Engineering College of Guizhou University，Guizhou University，Guiyang 550025，Guizhou，China）

Walnut polypeptide was obstained by enzymatic hydrolysis with the defatted walnut meal as raw material.The preparation process of walnut polypeptide was optimized on foundation of single factor experiment，according to Box-Behnken central composition design principle，the method of response surface analysis with 4 factors and 3 levels combined with Design Expert8.0.6-statistical data analysis software was adopted with the leaching rate of walnut polypeptide as the response value.The effect of substrate concentration，temperature，time and pH on the leaching rate of walnut polypeptide were studied in this paper.According to the above results，the optimum preparation conditions were obtained as follows：substrate concentration 2.3%，temperature 51℃，time 5.2 h，and pH 6.5.Under these conditions，the leaching rate of walnut polypeptide reached 0.45 g/g.

walnut polypeptide；enzymatic hydrolysis；response surface methodology；extraction process

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.006

2015-04-13

贵州省农业攻关项目（黔科合NZ［2013］3016）

王端（1992—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：食品与生物工程。

周鸿翔（1975—），男，副教授，研究方向：食品加工与生物技术。