天津医科大学第二医院（300211）吴建国 李宏 徐德生 王德胜 王伟

外伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是神经外科常见疾病，其致残率及致死率占全身各器官损伤之首。脑创伤后患者常伴有高级认知功能障碍，出现不同程度学习记忆能力下降，研究发现间充质干细胞可以改善脑创伤大鼠的认知功能[1]，且有研究认为脑损伤局部移植效果优于静脉移植，但实验多为单次注射移植[2]，本实验采用脂肪来源干细胞（adipose tissuederived stem cells，ADSCs）作为移植细胞。我们研究的内容是比较多次尾静脉移植与脑损伤局部单次移植在改善创伤性脑损伤大鼠空间记忆以及海马组织中脑源性神经生长因子mRNA的表达之间的差异。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雌性Sprague-Dawley大鼠3只，体质量200g，清洁级Sprague-Dawley大鼠80只，雌雄各半，体质量250～300 g，购于中国军事医学科学院动物实验室。实验过程中对动物的处置符合2006年中华人民共和国科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.1.2 试剂及仪器设备 液压打击装置（美国弗吉尼亚大学），小动物立体定向仪（山西万东医疗器械厂），ABI 7600 PCR仪(美国ABI公司)，Morris水迷宫, 超净化工作台（美国Thermo scientific ），流式细胞仪（美国BD公司），RNA提取试剂盒（北京天根生物科技有限公司），CD90，CD105，CD73，CD44，CD34，HLA-DR单克隆抗体（美国R&D公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脂肪来源干细胞的分离、培养和鉴定 参照Zuk等[3]的方法略加改良进行，取200g的SD大鼠3只，3%水合氯醛腹腔注射麻醉后断颈处死，无菌条件下取大鼠腹部脂肪组织，用无菌D-Hank's溶液反复冲洗标本，以去除污染物和红细胞。然后用I型胶原酶（0.075%）在37℃、150rpm 恒温振荡水浴摇床内消化样品30min。以去除细胞外基质，然后用等量体积的含有10%FBS的DMEM/F12培养基中和胶原酶活性，1200g离心10min，弃去上清，沉淀用红细胞裂解液重悬，100目筛网过滤，1200g离心5min，弃上清，沉淀重悬，细胞悬液用细胞记数板记数，以1.5×105/ml接种于75cm2培养瓶中，培养瓶中加入含10%胎牛血清及双抗的DMEM/F12培养基，在37℃，5%CO2，饱和湿度孵箱中过夜培养，然后用PBS反复冲洗以去除未贴壁的残存的血细胞，当细胞达70%～80%汇合时，胰酶常规消化，细胞按照1∶3进行传代。第4代细胞进行细胞学组织观察、表面标记物的流式细胞学检测以及成骨、成脂等多向分化培养，并制备成终浓度为以2.0×1012/L的单细胞悬液，待移植时用。

附表1 伤后28天各组Morris水迷宫试验结果（）

附表1 伤后28天各组Morris水迷宫试验结果（）

注：**P<0.05；*与对照组比较P<0.05；a与（3）比较 P>0.05。

组别（group） 鼠数（n） 逃避潜伏（s） 空间搜索目标象限路程（%） 目标象限时间（%） 穿越平台次（次）假伤组(1) 6 24.33±4.84* 30.67±3.67* 31.00±3.22* 7.83±1.17*对照组(2) 8 47.45±15.36 14.25±2.92 14.75±1.98 2.75±0.771尾静脉移植(3) 8 35.44±4.88* 26.11±3.10*a 22.78±2.17*a 6.00±1.22*a脑内移植组(4) 8 35.17±5.78* 24.56±2.88* 22.11±2.37* 5.78±1.20*P [（3）∶（4）] 0.948 0.542 0.572 0.632 F 7.252** 36.725** 42.577** 26.891**

附表2 各组不同时间BDNF mRNA的表达（）

附表2 各组不同时间BDNF mRNA的表达（）

注：**P<0.05；*与（2）比较P<0.05；a与（3）比较 P>0.05。

组别（group） 鼠数（n） 7d 14d 28d假伤组（1） 5 0.0955±0.0151 0.0844±0.1237 0.0824±0.0086对照组（2） 5 1.3389±0.0948 0.1034±0.1688 0.0952±0.0103尾静脉移植（3） 5 1.5860±0.1953* 2.3943±0.3346* 1.7405±0.2598*脑内移植组（4) 5 2.6606±0.2383* 2.4591±0.2781*a 1.8509±0.2189*a P [（3）∶（4）] 0.028 0.644 0.320 F 213.04** 191.25** 168.40**

附图1 酶消化法得到的ADSC表面抗原流式检测结果（设定PE显示为黑色，FITC显示为灰色）

1.2.2 实验动物分组及TBI模型制备 采用侧方液压打击法制作大鼠海马神经元创伤模型，打击能量为1.7～2.2atm[4][5]。将存活的76只大鼠随机分为4组：①尾静脉移植组：20只，分别于伤后1d、3d、7d动物麻醉后，2.0×106ADSCs自尾静脉注入体内；②脑内移植组：20只，伤后1d固定于立体定向仪上，常规备皮消毒后，根据大鼠立体定向图谱，通过微量注射器于海马背侧CA1区注射2.0×106ADSCs；③对照组：20只，造模成功后不做任何处理；④假伤组：16只，仅行头皮切开及钻孔，不做打击。

1.2.3 Morris水迷宫实验 创伤性脑损伤后23d行Morris水迷宫检测[6]，实验共5 d，定位航行实验：记录每次大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)。每天4次实验，分别从东南西北4个入水点随机放入水池，面向池壁，如在120 s内不能发现平台，将其放置于平台上30 s，每次实验间隔30 s，取4次测试的平均值做为当天的逃避潜伏期。空间搜索实验：第5天完成定位航行后，撤走站台，选择站台对面入水点，将大鼠面对盆壁放入水中，通过摄像机记录大鼠在2min内的游泳轨迹，应用荷兰Noldus公司Ethovision水迷宫分析系统计算大鼠在原站台所在象限的游泳时间、距离在水池内游泳的总时间、总距离的比值百分数和穿越原跳台次数以判断大鼠的学习和记忆能力。

附图2 多系分化后染色结果：A 成骨分化茜红素染色，B 成脂分化油红-O染色（×400）

1.2.4 RT-PCR法检测BDNF mRNA表达分别于损伤后7d、14d、28d，4组随机各取5只大鼠麻醉处死，开颅取损伤侧海马组织进行RT-PCR相关检测，首先抽提总mRNA，以反转录法(RT法)先合成cDNA，再进行PCR扩增；引物序列分别为：BDNF：F5’-AGA AGA GGA GGC TCC AAAGG-3’，R5’-AAA CAT CCG AGG ACA AGGTG-3’； 预扩增产物长为235 bp 。β-actin ：F5’-CCA TCA TGA AGT GTG ACG TTG-3’，R5’-ACA GAG TAC TTG CGC TCA GGA-3’；预扩增产物长为175 bp。PCR反应条件：94 ℃4 min，94 ℃ 35 s→57℃ 30 s→72 ℃ 30 s ，循环29次后，于72 ℃延伸7 min，每管适时加入内参β-actin引物，内参扩增30次。应用标准曲线法得到BDNF mRNA的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 ADSC的生物学特征和鉴定

ADSCs的细胞形态符合间充质细胞的表现，表面标志物流式细胞仪检测结果显示：P4细胞CD90，CD105，CD73阳性率分别为（99.02±0.35）%、（98.89±0.64）%、（99.01±0.84）%，而CD44，CD34，HLA-DR阳性率为（1.01±0.34）%，（2.43±0.21）%，（1.34±0.46）%。见附图1，因此可证明本实验所获得的ADSCs具有间充质干细胞的表面抗原特征，在成骨培养体系中培养3周后，茜红素染色阳性(见附图2-A)；在成脂肪培养体系中培养3周后，油红-O染色阳性(见附图2-B)；这说明所得到的细胞具有多向分化能力。

2.2 大鼠Morris水迷宫行为学检测

在Morris水迷宫检测前,对照组、尾静脉移植组、脑内移植组分别有2只、1只、1只大鼠死亡，各组平均潜伏时间均逐渐缩短，与TBI组相比，尾静脉移植组以及脑内移植组的平均潜伏时间减少，而穿越原平台次数、目标象限游泳时间占总时间的百分比增加，差别有统计学意义（P＜0.001) ，而尾静脉移植组以及脑内移植组两组间差异无统计学意义（P＞0.05),见附表1。

2.3 RT-PCR检测各组BDNF mRNA的表达伤后7d、14d、28d，脑内移植组、尾静脉移植组BDNF mRNA的相对表达量均高于对照组及假伤组，伤后7d时脑内移植组BDNF mRNA的相对表达量高于尾静脉移植组，差异有显著性意义(P< 0.05)，而在14d及28d时脑内移植组、尾静脉移植组两组之间无显著性差异(P> 0.05)，见附表2。

3 讨论

创伤性脑损伤是常见的意外伤害，有较高的致死率和致残率，且存活的患者也常会出现各种神经功能障碍，其中学习和记忆障碍等认知功能障碍是脑创伤患者最常见的并发症之一，严重影响该类患者的生活质量，目前的治疗方法是有限的。应用细胞治疗因创伤性脑损伤所造成的中枢神经系统损伤或功能障碍是新近发展起来并极有前景的神经系统疾病治疗策略之一。ADSCs除了与其他干细胞相似的自我更新和多潜能性之外，ADSCs还具有避免了免疫排斥反应，细胞来源较广泛，易于采集、制备、保存、对供体损伤小以及稳定转染和表达外源性基因等优点[4]。另外ADSCs可通过自体移植，因此不会涉及到社会、伦理及法律等诸多问题，是理想的移植用种子细胞。目前认为间充质细胞治疗脑损伤的可能的机制有促进生长因子的分泌，通过细胞间融合或接触交换基因和蛋白质，诱导血管生成以及免疫调节[7]。

移植移植的成功在很大程度上取决于移植物来源，移植时间窗及移植途径的选择。既往研究认为经尾静脉移植后细胞通过血脑屏障最终定植在大鼠脑组织损伤部位的数目较少，与脑损伤区移植相比无论是组织学还是功能学上治疗效果都较之略差，因为经尾静脉进行细胞移植，细胞必须先经过体循环才有可能达到损伤部位，在这期间大部分细胞会被机体的免疫系统所清除，进而倾向于选择脑损伤区移植，但脑损伤区移植可造成二次损伤，Mahmood等[8]研究表明经静脉移植也可明显改善脑损伤后大鼠的神经功能，认为MSC移植后主要是通过促进各种神经生长因子分泌而达到改善神经功能的，本实验通过经尾静脉多次移植增加移植的细胞数和作用时间进而发现其在定位航行能力和空间探索能力改善、BDNF mRNA的表达等方面与脑损伤区移植组间无显著差异，说明经尾静脉多次移植可以取得与脑损伤区移植相当的效果，且更加安全，对于复合性外伤而言，静脉移植在改善脑功能的同时，是否有利于其他损伤器官功能的修复尚需进一步研究明确。

总之，ADSCs移植为创伤后因海马神经元损伤而导致的记忆和认知功能障碍的改善提供了一种新的治疗选择，具有广阔的临床应用前景，不同移植途径在改善空间记忆障碍方面并无显著差别。