北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂（100079）武琳 杨光 黄菲

气管炎丸具有散寒镇咳，祛痰定喘的作用，用于外感风寒引起的气管炎发炎、肺热咳嗽、气促哮喘、喉中发痒、痰涎壅盛、胸膈满闷、老年痰喘等具有较好的疗效。本品收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》第四册[1]，由黄芩、五味子（醋炙）、青黛等三十味药材组成，而原标准中只收载了显微鉴别，不利于对药品质量可控性。为了更好地控制气管炎丸质量，本次研究通过建立五味子、青黛的薄层鉴别方法和黄芩的含量测定方法，完善了气管炎丸的质量标准，提高了气管炎丸的可控性。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器)，天平型号METTLER TOLEDO XP205型电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司)，CAMAG REPROSTAR3数码成像系统(瑞士CAMAG)，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率250 W，频率40 kHz)。

1.2 试剂 五味子甲素对照品（供含量测定用110764- 200107）、青黛对照药材（1170-200001）、黄芩苷对照品（供含量测定用110715-200514），对照品及对照药材均购自中国药品生物制品检定所；气管炎丸（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号6080771、6080767、6080768）；Merck薄层板TLC Silica gel 60和Merck薄层板TLC Silica gel 60F254（德国Merck默克公司）；配制标准溶液及供试品溶液的试剂均为分析纯，液相色谱用试剂为高效液相级试剂，液相用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 五味子 取供试品5g，研细，加二氯甲烷25ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇 2ml充分振摇，滤过，滤液作为供试品溶液。取不含五味子药材的阴性样品5g，同法制成阴性对照溶液。另取五味子甲素对照品，加二氯甲烷制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，吸取供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶7∶1) 的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，再展开一次，取出，晾干，置紫外灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，见附图1。

附图1 五味子薄层色谱图

2.1.2 青黛 取“2.1.1”项下供试品溶液作为供试品溶液。取不含青黛药材的阴性样品5g，同法制成阴性对照溶液。另取青黛对照药材50mg，加二氯甲烷5ml，充分搅拌，滤过，滤液作为对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，吸取供试品溶液和阴性对照溶液各20μl，对照药材溶液10μl ，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯－二氯甲烷－丙酮(4∶3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝色和浅紫色的斑点，且阴性对照无干扰，见附图2。

附图2 青黛薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Zorbax SBC18(4.6×150mm， 5μm)；流动相为甲醇：0.04%磷酸 (40∶60)；流量0.8mL·min－1；检测波长280 nm；柱温30℃。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。

图3 气管炎丸中黄芩苷高效液相色谱图

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品适量，加70%乙醇制成每1ml含25μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品适量，研成细粉，取约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加入70%乙醇45ml，超声处理（功率250W，频率40kHz）50min，放冷，再加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例取不含黄芩药材的其余药材，按其工艺制成空白制剂，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.2.5 空白干扰试验 精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各5μL，在上述色谱条件下进样，记录色谱图。结果黄芩苷可与其他成分基线分离，阴性对照溶液在与黄芩苷对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为空白无干扰。色谱图见附图3。

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取黄芩苷对照品溶液（0.13136mg/ml）0.2μl，0.5μl，1μl，2μl，3μl，4μl，5μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品的进样量（μg）为横坐标，以峰面积为纵坐标，结果表明黄芩苷在0.026272μg ～0.6568μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y=3466.60567x-3.84811，r=0.99999，可用外标一点法计算。

2.2.7 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次，测得黄芩苷含量的平均值为1.5539mg·g-1，RSD=0.71%，表明精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24h进样测定，测得黄芩苷含量的平均值为1.5195 mg·g-1，RSD值为0.71%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.9 重复性试验 精密称取同一批号(6080771)的样品6份，分别按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，黄芩苷含量的平均值为1.5391mg·g-1，RSD为2.01%。表明本方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品（批号6080771，含黄芩苷为1.5391 mg/g）6份，每份约0.25 g，分别精密加入黄芩苷对照品溶液（0.3940 mg·mL-1）1 mL，按“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定黄芩苷的含量，平均回收率为97.90%（n=6），RSD为1.43%，结果见附表1。

2.2.11 黄芩苷对照品纯度测定 精密称取黄芩苷对照品6mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取对照品溶液5μl注入液相色谱仪中，归一化法测定含量， 黄芩苷含量为99.72%

2.2.12 样品含量测定 取3批样品，按“2.2.3”项下的方法制成供试品溶液，每批样品测定3次，结果见附表2。

附表1 黄芩苷加样回收率试验

附表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 本研究增订了五味子和青黛的薄层色谱鉴别方法，在薄层鉴别供试品制备时，二者供试品处理方法一致，增加了该法的实用性，降低了检验成本，有利于以后的生产检验工作。青黛的特征鉴别方法参考了2010年版《中国华人民共和国药典》(一部)青黛项下收载方法[2]，将展开剂中的三氯甲烷换成了毒性更低的二氯甲烷，降低了展开剂的毒性，所得青黛斑点清晰，同法制备的阴性对照无干扰，经样品、阴性对照试验，确认该方法可行。分别考察了不同温度和不同湿度条件对分离效果的影响，结果表明在不同温湿度下，五味子和青黛所得主斑点清晰，且阴性无干扰，该法具有良好的耐用性。

3.2 在确定含量测定的供试品溶液制备中，比较了回流提取和超声提取方式，结果发现超声提取效果较好。通过对不同溶剂（甲醇、50%甲醇、70%乙醇、95%乙醇）超声提取对黄芩苷提取率的影响，结果表明70%乙醇超声提取，所得黄芩苷的提取率最高，故选用70%乙醇超声提取。通过比较了超声提取不同时间（30 min、40 min、50 min 、60min）对黄芩苷的提取率影响，结果表明提取50 min时，已基本提取完全，故确定提取时间为50 min。

本研究比较了不同流动相甲醇-0.04%磷酸 （40∶60）和甲醇-0.04%磷酸（47∶53），发现用甲醇-0.04%磷酸(40∶60)比甲醇-0.04%磷酸（47∶53）作为流动相所得黄芩苷峰的峰型好且阴性无干扰，故采用甲醇-0.04%磷酸（40∶60）作为本品含量测定的流动相。

综上所述，本研究增加了五味子、青黛的薄层鉴别方法，建立了高效液相色谱测定气管炎丸黄芩中黄芩苷含量的方法，操作简单、方便，实用。通过本次研究，提高了气管炎丸的质量标准，增加了气管炎丸的可控性。