黄达明 李倩 管国强 张志才 钱静亚 宋庆春

（江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013）

一株解磷细菌的筛选、鉴定及其溶磷培养条件的优化

黄达明 李倩 管国强 张志才 钱静亚 宋庆春

（江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013）

从土壤作物根际筛选分离出的一株解磷能力较强的溶磷菌P0417，对其进行16S rDNA基因水平上的初步鉴定，测定其溶解磷的能力，并对该菌的溶磷培养基条件进行优化。结果表明，经序列分析，确定该菌株P0417为洋葱伯克霍尔德氏菌。且其溶磷能力与培养液pH呈显著相关性，当培养基条件为葡萄糖10 g/L、草酸铵0.5 g/L、NaCl 1.0 g/L时，菌株P0417对Ca3（PO4）2盐培养基具有较好的解磷能力，其解磷能力可达791.84 μg/mL。

溶磷细菌；筛选；鉴定；条件优化；解磷能力

磷（P）是植物生长必需的矿物质元素之一，在植物体内以多种方式参与植物体内的光合作用和生理生化过程，对促进植物的生长发育和新陈代谢具有重要作用［1］。在我国，有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷为无效形式，植物很难直接吸收利用［2］，且施入的磷肥当季作物利用率为5%-25%，大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+和Al3+结合，形成难溶性磷酸盐［3］。

土壤微生物是土壤有机质转化的执行者，又是植物营养元素的活性库［4］。土壤中能解磷的微生物种类比较多，主要包括细菌、真菌和放线菌等［5］。目前报道的具有溶解Ca3（PO4）2的菌株主要包括芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）和伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）等［6］。不同的微生物解磷能力有较大的差异［7］，其溶磷量可达142.1-643.2 μg/mL［3，7，9］。其作用途径大多是依靠自身的代谢产物或与其他生物协同溶解土壤中的难溶性磷素，提高土壤中磷素的利用效率，减少化学肥料的施用量，对环境进行微生物修复，提高作物产量。微生物的解磷机制复杂多样，因菌株的不同而有所不同［8］。解磷细菌能够增加土壤有效磷含量，有三种观点：第一种观点是产酸机制，目前被人们广泛接受；第二种观点认为微生物的解磷作用主要是由于在其代谢过程中分泌质子的缘故，使介质的pH值降低；第三种观点认为微生物的解磷过程是一个动态的分段过程［9］。

目前，有关溶磷微生物的分离，筛选和应用的研究大都局限于农作物，在林木根际筛选和应用溶磷微生物的报道极少。许多科学家分别从不同的方面对微生物菌肥进行研究［10，11］，如进行高效解磷能力菌株的分离、将不同种类微生物混合而研究其组合效应等，所以筛选出具有高效溶磷能力的菌株显得尤为重要。本研究对筛选自桂树根际土壤的溶磷菌鉴定并进行溶解磷酸钙能力的测定，并对溶磷菌的培养条件进行优化，旨在为开发利用林木根际溶磷微生物资源及绿色无公害微生物肥料的生产提供高效稳定的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土壤 供试土壤为黑色土壤，于2013年9月采样，采用五点采样法采集桂花树下根际粘附的土壤，充分混合后分成2份：一份4℃冷藏保存，一份土样风干后过2 mm筛备用。

1.1.2 培养基 分离培养基（PKO培养基）：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）210 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，（NH4）2SO40.5 g，琼脂粉15 g，pH值7.0-7.2，水1 000 mL［Ca3（PO4）2单独灭菌后加入］。保存培养基（LB培养基）：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，水1 000 mL，琼脂15 g。

1.1.3 溶磷菌株的筛选分离 称取1 g土样溶于99 mL无菌水中，振荡30 min后取上清液用10倍稀释法分别配置10-3、10-4、10-5、10-6和10-7g/mL的土壤悬液，各取0.1 mL分别涂布到分离培养基上［12］，28℃培养10 d，观察出现溶磷圈的菌落，并将出现溶磷圈的菌株利用平板划线法分离纯化后，4℃下保存于LB斜面培养基中［13］。

1.2 方法

1.2.1 溶磷菌溶磷能力的测定

1.2.1.1 定性测定 溶磷圈法。将保存于LB培养基中的菌株活化后，用无菌牙签接种于含磷酸钙的PKO固体培养基上，倒置于28℃培养箱中培养10 d，记录溶磷圈直径（D）、菌落直径（d），并计算D/d值大小以初步确定菌株的溶磷能力。

1.2.1.2 定量测定 将菌株用LB液体培养基制成菌悬液（浓度约为109cell/mL，即波长660 nm，OD值1.0），按菌悬液与PKO液体培养基比例为 1∶100 接种，即每100 mL培养基接菌悬液1 mL，每菌株3次重复，以不接菌空白PKO液体培养基为对照。在28℃，150 r/min下摇床培养5 d后，取2 mL发酵液4 000 r/min离心10 min，采用钼蓝比色法［12］测定上清液有效磷含量，同时根据磷标准曲线［14］计算溶磷量，并测定上清液pH值。

1.2.2 菌株的鉴定

1.2.2.1 菌株菌落特征观察及生理生化性质 将单菌株接种LB培养基中进行活化培养，革兰氏染色观察细菌形态，培养液经梯度稀释后涂布平板，30℃倒置培养24 h，观察菌落形态。采用《常用细菌系统鉴定手册》进行初步菌株鉴定。

1.2.2.2 菌株的16S rDNA序列分析 利用菌体菌悬液直接PCR扩增16S rDNA，扩增引物采用细菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'），引物购买于南京金斯瑞生物科技有限公司。PCR反应体系为（25 μL）：Taq DNA聚合酶 0.25 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，菌体0.2 μL，引物各0.5 μL，去离子水17.05 μL。PCR扩增条件：95℃5 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1.5 min，共32个循环；72℃ 10 min。用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，PCR产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序后，测序结果提交GenBank中的Blast数据库进行同源性比对，经Clustal软件进行多重序列比较后，利用MEGA 5.0软件进行系统发育树的构建。

1.2.3 培养基的优化试验

1.2.3.1 碳源和氮源的筛选 在原有的PKO液体培养基的基础上首先对碳源（葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、麦芽糖）和氮源［（NH4）2SO4、草酸铵、NaNO3、牛肉浸膏］进行筛选。菌株在LB斜面上活化24 h后，按1.2.1方法制成菌悬液，按1%接种量接种于各碳、氮源培养基，每组3次重复，于28℃、150 r/min摇床培养5 d，以原PKO培养基不接菌为对照测溶磷量。

1.2.3.2 培养基组成的优化 确定最好的碳氮源后，设计了葡萄糖（5、10和15 g/L），草酸铵（0.1、0.5和1 g/L），NaCl（0.1、0.5和1 g/L）的3因素3水平的正交试验对培养基进行优化。选用L9（33）正交组合进行试验，其因素水平见表5。测定方法同1.2.3.1。

2 结果

2.1 菌株的筛选

在无机磷固体培养基平板上涂板，结果（图1）显示，平板上长满各种单菌落，且有的菌落产生了溶磷圈，产生溶磷圈的大小大致可说明此溶磷菌分解无机磷能力的强弱，从而可初步判断溶磷菌溶磷能力［15］。经筛选，得到一株具有明显溶磷圈（D/d≥2.0）的溶磷菌，标记为P0417。

2.2 溶磷菌溶磷能力的测定

2.2.1 定性测定 经溶磷圈法测定D/d值，在以磷酸钙为磷源的培养基上出现了明显且较大的透明圈，在培养第10 天，菌落直径d为7.0 mm，透明圈直径D为14.3 mm，D/d值为2.04，具有较强溶解难溶性磷酸钙的能力。菌株特征见表1。

表1 菌株P0417在LB培养基上的菌落特征

2.2.2 溶磷菌溶磷能力的定量测定 供试菌株P0417在接种24 h后开始测定菌液中可溶性磷含量及pH值，然后每隔24 h测一次。结果（图2）显示，随着接种时间的延长，pH值逐渐降低，可能发酵过程中分泌了有机酸，溶磷量随之逐渐升高，且在120 h时溶磷量达到503.53 μg/mL，说明该菌在培养120 h时的溶磷效果最佳。随后，pH值具有升高的趋势，溶磷量也随之降低。通过Spss16.0对数据进行统计学分析发现，溶磷菌P0417的溶磷量与pH之间存在显著的负相关关系（r=-0.940，P＜0.05），当培养液酸度降到pH5.58时，才有大量磷释放出来。

图2 溶磷菌培养液中溶磷量与pH的关系

2.3 菌株的鉴定

2.3.1 菌株P0417的形态特征 菌株P0417在LB平板上30℃培养24 h，菌落呈黄色、圆形、光滑、不透明，革兰氏染色呈阴性，菌体为短杆状（图3）。菌株淀粉水解试验、甲基红试验、V-P试验、硝酸盐还原试验及氧化酶试验呈阴性；吲哚试验和硫化氢试验呈阳性；能利用乳糖、葡萄糖和麦芽糖；石蕊牛奶试验产酸、胨化（表2）。

图3 P0417菌平板形态（A）及菌株革兰氏染色（400×）（B）

2.3.2 菌株的16S rDNA序列分析 菌株P0417经16S rDNA扩增，其PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得了约1 500 bp大小的片段。将PCR产物寄往南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果显示，所得基因片段为1 377 bp，经Blast比对（表3），并构建系统发育树（图4）可知，该菌株为洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia），将该序列提交到GenBank，登录号为KJ020934。

表2 菌株P0417的生理生化特征

表3 溶磷菌P0417 的16S rDNA及ITS基因的鉴定结果

图4 P0417的系统进化树

2.4 溶磷菌的优化培养

分别选用10 g/L的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉和麦芽糖作为碳源，以不接菌原PKO培养基为空白对照，培养120 h后计算得出溶磷菌发酵液溶磷量，结果（表4）表明，葡萄糖是溶磷菌生长最适合的碳源。以0.5 g/L的（NH4）2SO4、草酸铵、NaNO3和牛肉浸膏作为氮源供溶磷菌发酵培养，表5可知草酸铵能使溶磷菌达到较好的溶磷效果。

表4 不同碳源对溶磷菌P0417溶磷量的影响

表5 不同氮源对溶磷菌P0417溶磷量的影响

综合正交试验（表6）结果（表7）的K值和极差R大小与方差分析（表8）可知，影响供试菌P0417溶磷量的主次顺序为B＞C＞A，即氮源＞NaCl＞碳源，其中草酸铵含量为影响溶磷菌溶磷量的主要因素，其次是NaCl含量，最后是葡萄糖含量。故本试验对供试菌株的理论最优培养基配方为A2B2C3，即葡萄糖10 g/L、草酸铵0.5 g/L、NaCl 1.0 g/L。针对该条件进行了补充试验，对优化培养配方接种活化第2代供试菌株P0417，同条件下培养，溶磷量为765.74 μg/mL，比原优化前培养液溶磷效果高。证明通过培养基优化及正交试验，调整后的培养配方更有利于该菌的溶磷效果。

表6 正交试验因素水平

3 讨论

本试验从桂花树根际粘附土壤中分离筛选出一株高效溶磷菌株P0417，经16S rDNA序列分析，结合生理特征，初步鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia），属于伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）类。该菌群是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性杆菌，因其可以产生硝吡咯菌素、吩嗪、苯基吡咯等多种次生代谢产物而被广泛应用于生物防治、促进植物生长、生物修复等农业领域［16］，展现了其在农业生产上良好的应用前景。与此同时该菌又有一些种是人类的条件致病菌［17］，在医院常污染自来水、体温表、医疗器械等，造成医院内传播，导致各种疾病传染［18］。故区分环境菌和人体致病菌以及该菌是否具有致病性，这对应用于农业上的伯克霍尔德氏菌株进行风险评估无疑是必要的。但目前为止还没有可行的方法区分，借助细胞培养模型和动物模型的突变体分析将是今后可行方法之一［19］。

表7 L9（33）正交试验结果

表8 正交结果方差分析

关于伯克霍尔德氏菌的溶磷效果的研究少有报道，李纪顺等［20］发现伯克霍尔德氏菌B418同时可以刺激植物生长，固定大气中的氮，释放土壤中被固定的磷等重要元素，证明其综合效果非常明显。赵珂［21］分离出一株洋葱伯克霍尔德氏菌YM3-2S，在磷矿粉为唯一磷源时速效磷含量最高达40.96 μg/mL。黄静［22］分离出一株植物内生洋葱伯克霍尔德氏菌M2S2，在磷酸钙磷源条件下显著增加了玉米地上部、根部及总生物量。本试验在以Ca3（PO4）2作为唯一的磷源且培养基条件优化后该菌P0417溶磷量最大为791.84 μg/mL。

溶磷菌种类繁多，溶磷机制复杂［23］，但大多数研究者认为，微生物的解磷作用主要取决于其分泌有机酸量和种类，如柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸和乳酸等［24］。如彭帅［25］分离出一株解磷荧光假单胞菌能够产生葡萄糖酸，解磷量达24.5 μg/mL。本试验菌株P0417在接种24 h后开始测定菌液中可溶性磷含量及pH发现，随着接种时间的延长，pH值逐渐降低，溶磷量随之逐渐升高，说明发酵过程中可能分泌了有机酸，菌株分泌有机酸的种类测定是后续研究的主要内容之一。

4 结论

菌株P0417在以Ca3（PO4）2作为唯一的磷源时溶磷量为503.53 μg/mL，在培养基条件优化后溶磷量最大为791.84 μg/mL，是原有PKO培养基溶磷量的1.57倍，推测溶磷机制可能是分泌了有机酸，初步鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia），可能是一株优良的非致病性溶磷菌株。

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（责任编辑 马鑫）

Selection，Identification and Medium Optimization of a Phosphatesolubilizing Bacterium

Huang Daming Li Qian Guan Guoqiang Zhang Zhicai Qian Jingya Song Qingchun
（College of Food and Biology Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

A phosphorus-dissolving bacterial strain P0417 was isolated from crop rhizosphere soil and identified by the genetic identification of 16S rDNA， measuring capability of phosphate-solubilization and optimization of medium components here. The result demonstrated that the bacterium was identified as Burkholderia cepacia. And the capacity of dissolving the phosphate was closely correlated with the pH of its culture medium， the strain showed high phosphate-dissolving ability of 791.84 μg/mL in Ca3（PO4）2culture medium at glucose， 10 g/L；Ammonium oxalate， 0.5 g/L；NaCl， 1.0 g/L.

phosphorus-dissolving bacterial strains；selection；identification；medium optimization；phosphate-dissolving ability

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.026

2014-06-10

黄达明，男，教授，研究方向：农产品生物转化及综合利用；E-mail：damingh@163.com